ICSI – Insemination og medieskift

Formål

At sikre ICSI udføres i overensstemmelse med Fertilitetsenheden, Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.
 

Definition af begreber

ICSI: Intra Cytoplasmatisk Sperm Injektion

Beskrivelse

Baggrund, anvendelse og gyldighed

Det efterstræbes at aspirationen påbegyndes 36 timer efter at ægløsningssprøjten (hCG) er taget. Denne ordineres til patienterne i overensstemmelse hermed. Det optimale tidspunkt for ICSI-proceduren er 39-40 timer efter ægløsningssprøjten

Ansvar

Biologen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonale ansvarlig for, at nye medarbejder informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personligt ansvarligt for at proceduren efterleves i praksis.

Apparatur, utensilier og reagenser

Fremgangsmåde

Aspiration:

Aspirationen foregår som beskrevet i forskriften: "Aspiration".

Tidsberegning for ICSI-procedure

Det optimale tidspunkt for ICSI-proceduren er 39-40 timer efter ægløsningssprøjten (3 til 4 timer efter aspiration). Dette betyder, at ICSI’erne skal laves i den rækkefølge, de er blevet aspireret. Således vil der også er ICSI’er, der skal laves over middag.Tidspunktet for ICSI-proceduren noteres på dyrkningsskemaet og i databasen. Der angives et ca. tidspunkt, som ligger midt i mellem start- og sluttidspunkt.

 Denudering af oocytterne:

Klargøring af petriskål til denudering og opbevaring sker dagen før som beskrevet i forskriften "Klargøring til ICSI"

Før denuderingen samles aspirations-, dyrknings- og denuderingsbakker, tilhørende den patient der skal have lavet ICSI, i bordinkubator i den varme bænk. Alle skåle, der skal bruges under denudering/ICSI anbringes ligeledes i bordinkubator. Der gøres en denuderingspipette klar.

Oocytterne denuderes 2-4 af gangen:

• • Denudering skal laves i varm bænk.

• • Overfør 4 oocytter fra inseminationshullet i aspirationsbakken med pipette til første cumulasedråbe i første denuderingsskål. Er der flere end 4 oocyter i brønd 1, eller oocyter fordelt på brønd 1 og brønd 2, så tages ikke flere end 4 æg af gangen over til denuderingsskålen.

• • Oocytterne pipetteres op og ned et par gange indtil cummulusskyen begynder at løsne sig fra oocyterne. Overfør nu oocyterne til næste cumulasedråbe og pipetter op og ned igen, hvormed oocyterne renses yderligere og overføres til tredje cumulasedråbe og derfra hurtigt videre til første skylledråbe. Oocytter må alt i alt maksimalt befinde sig i cumulasen i 1 minut. Oocyterne behøver ikke at være renset helt fra cummulusceller, mens oocyterne befinder sig i cumulasedråberne.

• • Senest når oocyterne er overført til første gametdråbe, skiftes til en passende denuderingspipette. Man kan også skifte til denuderingspipette, når æggene stadig befinder sig i cumulase dråbe 2. eller 3.

• • Med denuderingspipette renses oocyterne for de resterne cummulusceller. Ved denne proces overføres oocyterne fra skylledråbe til skylledråbe til oocyterne er renset tilstrækkeligt. Vurder modningsgraden under det omvendte mikroskop Nikon Eclipse TE2000S eller i stereomikroskop.

• • Findes der GV oocytter noteres dette på dyrkningsskema og disse kasseres, da der kun udføres kun ICSI på MII-oocytter (hvor der findes et synligt pollegeme). Ved mistanke om MI oocytter, foretages den endelige vurdering ved ICSI-mikroskopet i forbindelse med selve ICSI’en.

• • Overfør oocytterne til en tom brønd med fertiliseringsmedie i aspirations-bakken efter vurderingen og anbring skålen i bordinkubator.Gentag proceduren til alle oocytter er denuderet.

Klargøring af petriskåle til ICSI:

Der laves en petriskål pr. 4 oocytter.

Klargøringen af petriskålene foregår i sterilbænken udenfor varmefeltet for at undgå fordampning.

• • Petriskålenes låg er klargjort dagen i forvejen med navn og CPR nr.

• • Tag forvarmet gametbuffer ud af varmeskab og olie ud af Panasonic incubator og PVP ud af køleskab.

• • Placer ca. 5-8 µl PVP i midten af petriskålen, som vist på tegningen nedenunder.

• • Placer 4 dråber Gamet buffer á ca. 5-8 µl omkring PVP-dråben, som vist på tegningen nedenunder. 

• • Dråberne overlejres med ca. 3,5 ml olie.

• • Stil petriskålene i bordinkubator inkubator indtil brug.

• • ICSI-skålen skal optimalt laves ca 20 minutter før oocyterne overføres til ICSI-skålen.

Klargøring af mikroskop og montering af holde- og injektionspipetter:

• • Kør injektionspipetten frem, så der er råderum til skift af pipetter

• • Kasser brugte pipetter, hvis det ikke er gjort efter forrige procedure

• • Kør evt. div. manipulationsudstyr i midterposition

• • Kontroller at der er olie i glassprøjten.

• • Kør olie ud af holder indtil der ikke kommer luft længere.

• • Sæt holdepipetten i venstre holder.

• • Sæt injektionspipetten i højre holder, i en ensrettet bevægelse til den ikke kan komme længere ind.

• • Indstil objektivet på x10 forstørrelse.

• • Sørg for at begge joysticks hænger lodret.

• • Fokuser på holdepipetten og indstil denne i vandret position.

• • Fokuser på injektionspipetten og stil også denne i vandret position.

• • Indstil begge pipetter overfor hinanden i krydset der ses i mikroskopets synsfelt.

• • Kontroller at injektionspipetten sidder korrekt ved at stille skarpt på spidsen og sænk pipetten ved at dreje joysticket ned med uret. Pipetten skal blive skarpere mod højre.

• • Skift nu til 20x forstørrelse og efterjuster pipetternes position, hvis nødvendigt. Skift nu til 40x forstørrelse.

• • Stil skarpt på både holdepipette og injektionspipette.

• • Kontroller evt. at begge pipetter er korrekt indstillet, ved forsigtigt at føre injektionspipetten ind i holdepipetten.

• • Kør holdepipetten til venstre så kun spidsen er synlig.

• • Hæv begge pipetter.

Så er ICSI apparatet klar til brug.

ICSI-Procedure:

• • Tag spermsuspension og petriskål fra Panasonic incubator.

• • Tilsæt under mikroskop ca. 2 µl sædprøve til PVP-dråben (nederst eller i venstre side af PVP dråben)

• • Stil spermsuspensionen tilbage i Panasonic incubator.

• • I tilfælde af 'sløve' sædceller, kan petriskålen stå i incubatoren i et par minutter for at sædcellerne får en chance for at svømme ud i PVP-dråben.

• • Tag Asp-bakkern med oocyterne ud af bordplade inbubator, og overfør én oocyt til hver dråbe med Gamet buffer i ICSI-skålen; altså max. 4 oocyter

• • Stil Asp-bakken tilbage i bordinkubator .

• • Placer petriskålen under Nicon TE2000E med ICSI-udstyret og fokuser på den øvre venstre kant af PVP-dråben og stil skarpt.

• • Sørg for at holde holdepipetten er over PVP-dråben, da der ikke må komme sædceller på denne.

• • Kør injektionspipetten ned og indstil den så spidsen er skarp. Derved sikres, at sædceller og pipette er i samme plan.

• • Sug PVP op i injektionspipetten og giv et forsigtigt modpust, indtil pipetten hverken suger eller puster.

• • Find en motil sædcelle med korrekt morfologisk udseende. Sædcellen skal udvælges ved 40x forstørrelse.

• • Løft injektionspipetten over midten af halen, sænk pipetten igen og lav et lille ryk med den, så halen får et knæk, og sædcellen immobiliseres. Undgå berøring med sædcellens hoved eller midtstykke.

• • Sug sædcellen ca. en tredjedel op i injektionspipettens nederste del med halen først og sørg for at sædcellens placering i pipetten er helt i ro. Sædcellens hale kan med fordel rettes helt ud før den suges op i pipetten

• • Kør injektionspipetten så langt op, at der ikke er risiko for, at injektionspipetten overfør flere sædceller til dråben med oocyten.

• • Flyt petriskålen således, at den første oocyt kommer til syne.

• • Stil skarpt på oolemma (oocytens membran). Dette gøres optimalt ved 40x forstørrelse. Det samme gælde selve injektion af sædcellen i ægget. 

• • Kør injektionspipetten ned, så sædcellen kan ses. Indstil injektionspipetten så spidsen ses skarpt.

• • Sænk holdepipetten ned. Indstil så spidsen ses skarpt

• • Manipuler oocytten med pipetterne, så oocytten har pollegemet i kl. 11-12 eller kl. 6-7 position og sug den fast med holdepipetten. Stil evt. skarpt på oocyttens oolemma (oocytens cellemembran) igen.

• • Kør sædcellen langsomt ud til spidsen af pipetten, så der undgås at injicere for meget PVP i oocytten. Når sædcellen er helt ude i spidsen, trykkes pipetten mod oocytten til zona og oolemma (cellemembranen) giver efter.

• • Når pipetten er inde i oocytten, suges let tilbage i injektionspipetten til der ses et ryk af cytoplasma inde i pipetten. Dette ryk betyder, at der er kommet hul i oolemma.

• • Cytoplasmaet injiceres derefter forsigtigt og med jævn fart tilbage i oocytten.

• • Aflevér sædcellen midt i eller til venstre for midten af oocytten og træk pipetten langsomt ud. Ved brug af vores nye injektionssprøjte (baseret på luft), skal man skrue ret resulut for at bevægelsen forplaner sig i en hensigtmæssig styrke til sug og pust bevægelse i selve pipetten. Betjener man sug og pust bevægelsen for forsigtigt kan man få problemer med at oolemma først brister, når man har suget sædcellen langt op i injektionspipetten, ud af syne i mikroskop.

• • Proceduren gentages til alle oocytter i ICSI petriskålen er injiceret med en sædcelle.

• • Umiddelbart efter injektionen skylles oocyterne i i Asp-bakkens brønden med cleavage medie.

• • Flyt oocytterne nu over til EmbryoSlides eller dyrkningsskåle således:

  • o EmbryoSlides: Oocytterne overføres med en passende pipette til hvert deres hul i EmbryoSliden, husk at kontrollere for luftbobler

  • o Dyrkningsskåle: Oocyterne overføres med en passende pipette til hvert deres dyrkningsdråbe

• • obs: hvis der har været afvigelser for én eller flere af oocytterne skal disse holdes adskilt, og afvigelsen noteres ud for oocyttens nr. på dyrkningsskemaet.

• • MI og GV oocytter skal ikke injiceres, og skal derfor ikke overføres til dyrkningsskåle/Embryoslides.

• • Noter på dyrkningsskemaet med et x hvor oocytterne ligger.

• • Dyrkningsbakker stilles herefter i Panasonic incubator 1 eller i EmbryoScope

• • Dyrkningsskema udfyldes med initialer og tidspunkt for ISCI-proceduren.

• • Desuden lægges der data i formatex