Modtagelse og gradientcentrifugering af partnersæd til IVF og ICSI
Formål
At sikre, at korrekt modtagelse, håndtering og forarbejdning af partnersæd til IVF og ICSI (In Vitro Fertilisering og Intra Cytoplasmatisk Sædcelle Injektion) sker i overensstemmelse med Fertilitetsenheden Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.
Beskrivelse
Baggrund, anvendelse og gyldighed
Intet særskilt at bemærke.
Ansvar
Laboratorielederen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonalet ansvarlig for, at nye medarbejdere informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personlig ansvarlig for, at proceduren efterleves i praksis.
Fremgangsmåde
Beholder til sædprøve forsynet med uxors navn og CPR-nummer er ved konsultation udleveret til uxor af enten læge eller sygeplejerske. Sædprøven afleveres personligt til en sygeplejerske eller andet personale på Fertilitetsenheden, der i forbindelse med modtagelsen kontrollerer, at der er patientlabel på containeren, og at følgesedlen er udfyldt og underskrevet. Det tilstræbes at prøven er så frisk som muligt, og helst ikke mere end 1 time gammel. Har parret for eksempel over 1 times transport til klinikken anbefales det, at prøven laves ved fremmøde. Ønsker manden at lave sædprøven på stedet, skal parret møde ½ time før det aftalte tidspunkt. Når prøven er nylavet, skal den stå ved stuetemperatur i ca. 15 minutter, til den er homogen (flydende), før den analyseres. For hurtigere homogenisering af prøven, kan man med fordel suge sædvæsken op og ned med en plastikpipette og ryste prøven. Det gælder dog altid, at sædoprensningen bør påbegyndes så HURTIGT som muligt efter modtagelsen, da sædcellerne udsættes for betydelig oxidativ stress, så længe de befinder sig i sædvæsken.
Klargøring
Klargjort stativ med gradientmedie findes på hylden ved siden af sædbordet. Klargjort stativ med MHM og spidsglas med patient id findes på hylden over sædbordet. Antallet af spidsglas der skal benyttes afhænger dels af prøvens koncentration, dels af prøvens volumen. Der må maksimalt afpipetteres 2 ml af sædprøven i hvert spidsglas. Klargjort stativ med CSCM dyrkningsmedie står i CO2 inkubator.
Procedure
1. Volumen af sædprøven vurderes enten ved aflæsning på glasset, ved hjælp af plastpipette eller efter opsætning til gradientcentrifugering. Resultatet noteres på patientens følgeseddel og dyrkningsskema.
2. Ca. 10 µl af prøven påsættes Makler kammeret, og koncentrationen af motile, immotile og totale sædceller bestemmes som mill/ml under mikroskop. Alle værdier noteres på patientens følgeseddel og dyrkningsskema.
3. De klargjorte spidsglas opsættes til gradientcentrifugering således:
• Ca. 2 ml gradientmedie ISolate Upper 50 (medie med lavest viskositet) afpipetteres i hvert glas.
• Ca. 2 ml gradientmedie ISolate Lower 90 (medie med højest viskositet) underlejres i hvert glas.
• Ca. 1-2 ml af sædprøven overlejres i hvert spidsglas.
4. Spidsglassene centrifugeres 20 minutter ved 1316 rpm (300 G).
5. Efter centrifugering opsuges de overliggende gradientlag forsigtigt med en pipette og kasseres. Undgå kontakt med cellepellet.
Den efterfølgende procedure afhænger af befrugtningsmetode (konventionel IVF eller ICSI) og er derfor beskrevet
separat.
6.
Konventionel IVF | ICSI |
Tilsæt lidt MHM til cellepellet i spidsglasset. Sug pellet et par gange op og ned i pipetten for at blande det med medie. | Ca. 5 ml MHM afpipetteres i et nyt spidsglas (mærket med patient-label). Herfra overføres lidt medie til pellet i spidsglasset. Sug pellet et par gange op og ned i pipetten for at blande det med medie. |
Alt medie med det opslæmmede pellet overføres direkte til det klargjorte spidsglas indeholdende 5 ml MHM (mærket med patient-label). Igen suges grundigt op og ned for at vaske sædcellerne grundigt. | Overfør alt medie med det opslæmmede pellet til det nye spidsglas, igen suges grundigt op og ned for at vaske sædcellerne grundigt. |
7. Spidsglasset centrifugeres 7 minutter ved 1316 rpm (300 G).
8. Herefter suges supernatanten fra og kasseres.
9.
Konventionel IVF | ICSI |
Tilsæt 2-3 ml CSCM dyrkningsmedie til den tilbageblevne pellet og vask grundigt ved at suge op og ned med pipetten. HUSK at sætte CSCM dyrkningsmedie i CO2 inkubator med lettet låg, mens prøverne centrifugerer. | Tilsæt 2-3 ml MHM buffer til den tilbageblevne pellet og vask grundigt ved at suge op og ned med pipetten. |
10. Centrifuger igen i 7 minutter ved 1316 rpm (300 G).
11. Herefter suges supernatanten fra og kasseres.
12.
Konventionel IVF | ICSI |
Cellepellet opslæmmes i 1 ml CSCM dyrkningsmedie. | Cellepellet opslæmmes i 1 ml MHM |
| For prøver, hvor der forventes <1 mill/ml motile sædceller, skal pellet opslæmmes i mindre MHM |
13. Ca. 10 µl af prøven påsættes Makler kammeret, og koncentrationen af motile sædceller bestemmes som mill/ml under mikroskop. Desuden angives i procent, hvor mange af de motile sædceller, der er progressivt motile. Hvis pellet er opslæmmet i få dråber og der tælles få sædceller angives resultatet som <1 mill/ml motile sædceller. Alle værdier noteres på patientens følgeseddel og dyrkningsskema.
14.
Konventionel IVF | ICSI |
Hvis koncentrationen er under 2 mill/ml motile sædceller, diskuteres den videre procedure. | Hvis pellet er opslæmmet i få dråber og der tælles få sædceller angives resultatet som <1 mill/ml motile sædceller. |
15. Prøven fortyndes så der opnås en slutkoncentration på 3 mill/ml motile sædceller til IVF og hvis muligt 1-2 mill/ml motile sædceller til ICSI (prøven kan evt. opkoncentreres ved centrifugering).
16. Den fortyndede prøve eftertælles og slutkoncentrationen noteres på følgesedlen og dyrkningsskemaet.
17. Oprensede sædceller til IVF stilles i CO2 inkubator med lettet låg indtil brug og oprensede sædceller til ICSI stilles på sædbordet med tætsluttet låg.
18. Alle resultater noteres på dyrkningsskema og i Formatex. ”Klargør” prøven i Formatex.
