Optøning og oprensning af selvvalgt donorsæd til IUI-D/IVF-D/ICSI-D

Formål

At sikre at udvælgelse, optøning og oprensning af sædstrå sker i overensstemmelse med Fertilitetsenheden Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.

Definition af begreber

IUI-D: Intra Uterin Insemination med Donorsæd

IVF-D: In Vitro Fertilisering med Donorsæd

ICSI-D: Intra Cytoplasmatisk Sperm Injektion med Donorsæd

Beskrivelse

Baggrund, anvendelse og gyldighed
Alle patienter skal selv bestille donor IUI-ready strå. Undtagelsesvis kan der bestilles ICI-strå. Det er ikke tilladt at benytte sæd fra blokerede donorer, eller fra donorer der har opnået deres graviditetskvote i Danmark. Derfor SKAL alle donorer kontrolleres. Se fremgangsmetoden i proceduren ”Kontrol af donorblokering inden brug”.

Der anvendes følgende farvekodning til IUI-skema med donorsæd:

• • Blå: heterologe par.

• • Grøn: enlige.

• • Rød: lesbiske par.

Der anvendes følgende farvekodning til IVF/ICSI dyrkningsskema med donorsæd:

• • Hvid (Det samme som til IVF-H/ICSI-H) – der anvendes kulørt chartek til dyrkningsskemaet (anvend samme farvekodning som beskrevet til IUI ovenfor).

Ansvar

Laboratorielederen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonalet ansvarlig for, at nye medarbejdere informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personlig ansvarlig for, at proceduren efterleves i praksis.

Fremgangsmåde for IUI-ready strå

Patienten bestiller fortrinsvis MOT10 til alle behandlinger, dog kan der til IVF/ICSI undtagelsesvis vælges MOT5.

Den valgte donor er noteret på patientens IUI-skema eller dyrkningsskema.

Donorstråets placering i GT38 kan findes på patientens journalforside i Formatex, under ”Fryser”.

Strå optøs ved stuetemperatur i ca. 15 – 30 min.

Fremgangsmåde for IUI-ready strå til IUI-D

IUI-ready strået kan bruges direkte til insemination og inseminationen skal ske indenfor 60 minutter efter strået er taget ud af flydende kvælstof.

1. 1. Strået tømmes i et spidsglas, der er klargjort med patientens navn, CPR-nummer og donor ID.

2. 2. Ca. 10 µl af prøven påsættes Makler kammeret og koncentrationen af motile sædceller bestemmes som mill/ml under mikroskop. Desuden angives i procent, hvor mange af de motile sædceller, der er progressivt motile. Alle resultater noteres på patientens IUI skema.

3. 3. Der skal kun tælles i 5 felter i Makler kammeret. Alternativt kan prøven tælles i alle 10 felter og resultatet divideres med 2.

4. 4. Prøven stilles ved stuetemperatur med tætlukket låg indtil brug.

5. 5. ”Optø”, ”Oprens” og ”Klargør” prøven i Formatex.

Fremgangsmåde for IUI-ready strå til IVF-D/ICSI-D

IUI-ready strå skal vaskes med vaskemedie inden det anvendes til IVF eller ICSI.

Strået tømmes i et spidsglas, der er klargjort med patientens navn, CPR-nummer og donor ID.

1. 1. Ca. 10 µl af prøven påsættes Makler kammeret, og koncentrationen af motile, immotile og totale sædceller bestemmes som mill/ml under mikroskop. Dette gøres med henblik på refusion af stråets værdi, hvis det viser sig, at det ikke oprenses til 3 mill/ml motile sædceller.

2. 2. Tilsæt herefter ca. 2 ml medie (IVF: CSCM dyrkningsmedie; ICSI: MHM medie) til sædopløsningen, som vaskes med mediet ved at suge op og ned med pipetten.

3. 3. Spidsglasset centrifugeres 7 minutter ved 1316 rpm (300 G). HUSK at sætte CSCM dyrkningsmedie i CO₂ inkubator med lettet låg, mens prøverne centrifugerer.

4. 4. Herefter suges supernatanten fra og kasseres.

5. 5. Pellet opslæmmes i 1 ml medie (IVF: CSCM dyrkningsmedie; ICSI: MHM medie). Ved ICSI prøver, hvor der forventes <1 mill/ml motile sædceller, skal pellet opslæmmes i mindre MHM medie.

6. 6. Ca. 10 µl af prøven påsættes Makler kammeret, og koncentrationen af motile sædceller bestemmes som mill/ml under mikroskop. Desuden angives i procent, hvor mange af de motile sædceller, der er progressivt motile. Hvis pellet er opslæmmet i få dråber og der tælles få sædceller angives resultatet som <1 mill/ml motile sædceller. Alle værdier noteres på patientens dyrkningsskema.

7. 7. Hvis koncentrationen er under 2 mill/ml motile sædceller for en prøve til IVF, diskuteres den videre procedure.

8. 8. Prøven fortyndes så der opnås en slutkoncentration på 3 mill/ml motile sædceller til IVF og hvis muligt 1-2 mill/ml motile sædceller til ICSI (prøven kan evt. opkoncentreres ved centrifugering).

9. 9. Den fortyndede prøve eftertælles og slutkoncentrationen noteres på dyrkningsskemaet.

10. 10. Sædprøver til IVF stilles i CO₂ inkubator med lettet låg indtil brug og ved ICSI stilles prøven ved stuetemperatur med tætlukket låg.

11. 11. Alle resultater noteres på dyrkningsskema.

12. 12. ”Optø” og indskriv koncentrationen af motile spermatozoer før oprensning og ”Klargør” prøven i Formatex.

Fremgangsmåde for ICI-strå

Den valgte donor er noteret på patientens IUI-skema eller dyrkningsskemaet.

Donorstråets placering i GT38 kan findes på patientens journalforside i Formatex, under ”Fryser”.

1. 13. Strå optøs ved stuetemperatur i ca. 15 – 30 min. De klargjorte spidsglas opsættes til gradientcentrifugering således:

• • Ca. 2 ml gradientmedie ISolate Upper 50 (medie med lavest viskositet) afpipetteres i hvert glas.

• • Ca. 2 ml gradientmedie ISolate Lower 90 (medie med højest viskositet) underlejres i hvert glas.

• • Når stråene er optøet tømmes de, ét ad gangen, ovenpå gradienten i spidsglasset, som beskrevet nedenfor:

1. 14. Ca. 10 µl af prøven påsættes Makler kammeret, og koncentrationen af motile, imotile og totale sædceller bestemmes som mill/ml under mikroskop. Dette gøres med henblik på refusion af stråets værdi, hvis det viser sig ikke at kan oprenses til 3 mill/ml motile sædceller.

Tømning af CBS-strå med sprøjte

1. 15. Connection adapter sættes på 1 ml sprøjte fyldt med luft.

1. 16. Strået tørres af på ydersiden med en serviet.

2. 17. Klip svejsningen lige over ID-pinden af.

3. 18. Connection adapter med sprøjte sættes på CBS-strået ved ID-pinden. Den skal slutte helt til.

4. 19. Klip svejsningen af i den modsatte ende af CBS-strået.

5. 20. Ved at presse luft langsomt og kontrolleret gennem strået vil sæden tømmes ud.

Tømning af CBS-strå med træpind:

1. 1. Strået tørres af på ydersiden med en serviet.

2. 2. Klip svejsningen lige over ID-pinden af.

3. 3. Klip forsigtigt svejsningen i den anden ende.

4. 4. Sæt træpinden i den øverste åbning.

5. 5. Tryk forsigtigt træpinden ned igennem strået til vægen/vattet kommer til syne og sæden vil tømmes ud.

Tømning af CBS-strå med saks:

1. 1. Strået tørres af på ydersiden med en serviet.

2. 2. Klip den nederste svejsning af uden at komme i kontakt med sæden.

3. 3. Hold strået ned i glasset med den åbne ende tæt ved gradienten.

4. 4. Klip forsigtigt svejsningen i den anden ende, lige under filt-proppen, og sæden vil løbe ud af sig selv.

Gradientcentrifugering til IUI-D for ICI-strå

1. 1. Spidsglassene centrifugeres 20 minutter ved 1316 rpm (300 G).

2. 2. Efter centrifugering opsuges de overliggende gradientlag forsigtigt med en pipette og kasseres, undgå kontakt med pellet.

3. 3. Ca. 5 ml MHM medie afpipetteres i et nyt spidsglas (mærket med patient-label), herfra overføres lidt medie til pellet i spidsglasset. Sug pellet et par gange op og ned i pipetten for at blande det med mediet

4. 4. Overfør alt medie med det opslæmmede pellet til et nyt spidsglas, igen suges grundigt op og ned, for at vaske sædcellerne godt med mediet.

5. 5. Spidsglasset centrifugeres 7 minutter ved 1316 rpm (300 G).

6. 6. Herefter suges supernatanten fra og kasseres.

7. 7. Tilsæt 2-3 ml MHM medie til den tilbageblevne pellet og vask grundigt ved at suge op og ned med pipetten.

8. 8. Centrifuger igen i 7 minutter ved 1316 rpm (300 G).

9. 9. Efter sidste centrifugering suges supernatanten fra og pellet opslæmmes i 0,5 ml MHM medie.

10. 10. Ca. 10 µl af prøven påsættes Makler kammeret og koncentrationen af motile sædceller bestemmes som mill/ml under mikroskop. Desuden angives i procent, hvor mange af de motile sædceller, der er progressivt motile. Alle resultater noteres på patientens IUI-skema.

11. 11. Der skal kun tælles i 5 felter i Makler kammeret. Alternativt kan prøven tælles i alle 10 felter og resultatet divideres med 2.

12. 12. Prøven stilles ved stuetemperatur med tætlukket låg indtil brug.

13. 13. ”Optø”, ”Oprens” og ”Klargør” prøven i Formatex.

Gradientcentrifugering til IVF-D eller ICSI-D for ICI-strå

1. 1. Spidsglassene centrifugeres 20 minutter ved 1316 rpm (300 G).

2. 2. Efter centrifugering opsuges de overliggende gradientlag forsigtigt med en pipette og kasseres, undgå kontakt med pellet.

3. 3. Ca. 5 ml MHM medie afpipetteres i et nyt spidsglas (mærket med patient-label), herfra overføres lidt medie til pellet i spidsglasset. Sug pellet et par gange op og ned i pipetten for at blande det med mediet.

4. 4. Overfør alt medie med det opslæmmede pellet til det nye spidsglas, igen suges grundigt op og ned, for at vaske sædcellerne godt med mediet.

5. 5. Spidsglasset centrifugeres 7 minutter ved 1316 rpm (300 G).

6. 6. Herefter suges supernatanten fra og kasseres.

7. 7. Tilsæt 2-3 ml medie (IVF: CSCM dyrkningsmedie; ICSI: MHM medie) til det opslæmmede pellet og vask det grundigt med mediet ved at suge op og ned med pipetten.

8. 8. Centrifuger igen i 7 minutter ved 1316 rpm (300 G). HUSK at sætte CSCM dyrkningsmedie i CO₂ inkubator med lettet låg, mens prøverne centrifugerer.

9. 9. Efter sidste centrifugering suges supernatanten fra og pellet opslæmmes i 1 ml medie (IVF: CSCM dyrkningsmedie; ICSI: MHM medie). Ved ICSI prøver hvor der forventes <1 mill/ml motile sædceller, skal pellet opslæmmes i mindre MHM medie.

10. 10. Ca. 10 µl af prøven påsættes Makler kammeret, og koncentrationen af motile sædceller bestemmes som mill/ml under mikroskop. Desuden angives i procent, hvor mange af de motile sædceller, der er progressivt motile. Alle værdier noteres på patientens dyrkningsskema.

11. 11. Hvis koncentrationen er under 2 mill/ml motile sædceller for en prøve til IVF, diskuteres den videre procedure.

12. 12. Prøven fortyndes så der opnås en slutkoncentration på 3 mill/ml motile sædceller til IVF og hvis muligt 1-2 mill/ml motile sædceller til ICSI (prøven kan evt. opkoncentreres ved centrifugering).

13. 13. Den fortyndede prøve eftertælles og slutkoncentrationen noteres på dyrkningsskemaet.

14. 14. Den oprensede sædprøve til IVF stilles i CO₂ inkubator med lettet låg og prøven til ICSI placeres ved stuetemperatur med tætlukket låg indtil brug.

15. 15. Alle resultater noteres på dyrkningsskema og i Formatex.

16. 16. ”Optø”, ”Oprens” og ”Klargør” prøven i Formatex.