Ignorer kommandoer på båndet
Gå til hovedindhold

PGT laboratorie procedure, inklusiv klargøring til biopsi, bioptering og efterfølgende præparering af biopterede celler ved PGT behandling på Fertilitetsenhed AaUH

 

Formål

At sikre korrekt klargøring af medier og utensilier forud for biopsi, bioptering og efterfølgende præparering af biopterede celler i overensstemmelse med Fertilitetsenheden, Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.
 

Definition af begreber

PGT (Præimplantations Genetisk Diagnostik) behandling indebærer biopsi af udtagne, ICSI befrugtede (Intra Cytoplaspatisk sperm Injektion) ægceller, på blastocyststadie. Biopsien undersøges for arveligt betingede sygdomme på molekylær genetisk afdeling, hvorved den aktuelle blastocyst kan erklæres enten påvirket eller ej. Der anvendes PCR (Polymerase Chain Reaction) og NGS (Next Generation Sequencing) på molekylærbiologisk afdeling til udredning af sygdom. ICM (Inner Cell Mass). TE (Trophektoderm)

 

Beskrivelse

 
Ansvar

Biologen har det overordnede ansvar for at der informeres og undervises i proceduren. I den daglige drift er det dedikerede laboratoriepersonales ansvar at opretholde den nødvendige rutine der kræves for at proceduren kan efterleves i praksis.

 

Procedure, når PGT patienten melder sig til behandling:

  • • Sekretærerne skriver mail til PGT-lab og Molekylærbiologerne, når en patient melder sig til IVF-behandling med oplysning om patientens navn og CPR.nr samt dato for FSH-start.

  • • Molekylærbiologerne svarer tilbage til PGT-lab, hvilken analysemetode, der skal bruges.

  • • PGT-lab sørger for at printe mailen med analysemetoden ud og noterer FSH-start på kalenderen.

  • • I mailen overstreges navn, CPR.nr og analysemetode. Mailen placeres i plasticlomme i mappen ”PGT”.

  • • Tjek om patienten har blastocyster, der skal rebiopteres i mappen ”PGT Inkonklusive og afsluttede uden svar”. Hvis dette er tilfældet sættes ”Husk Rebiopsi”-skilt sammen med mailen.

 

Renlighed i PGT laboratoriet

Af hensyn til kontaminerings risiko skal al omgang i PGT laboratoriet foregå i ført hårnet, mundbind og handsker. Til selve PGT procedurer skal der desuden bruges OP-kittel med sterile handsker trukket hen over kitlens ærmer.

 

Fremgangsmåde

 

Klargøring af medier dagen før

Dagen før biopsitagningen skal følgende medier stilles til opvarmning/ækvillibrering i PGT inkubator (al håndtering foregår med handsker, mundbind og OP-hue)

  • • 1 ubrudt flaske olie pr. 8 forventede biopsier (låget åbnes inden flasken anbringes i inkubator)

  • • 1 stk. 3 cm petriskål til vitrifikation pr. forventet biopsi (to dråber blastocyst medie ca. 25µl, overlejret med olie)

Klargøring og mærkning af utensilier:

Utensilier til alle aktuelle patienter gøres klar dagen før.

Alle utensilier skal anbringes i flowbænk til UV belysning (brug handsker, mundbind og hårnet ved håndtering af utensilier) natten over. På selve biopsitagnings dagen, er det nok at UV-belyse utensilierne i 10 min. mellem patienterne.

 

  • • Pr. patient skal følgende utensilier klargøres

  • • 1 stk. 35 mm petriskål (til pipetteskyl)

  • • 1 stk. 6 cm petriskål til indstilling af pipette

  • • 2 stk. 6 cm petriskåle pr. forventet biopsi (biopsi og skyl)

  • • 1 handling pipette (133-135µm pipette) pr. forventet biopsi

  • • 1 rack til PCR rør under ”handlings” processen og ét rack per ny dag 5 patient

  • • 1 holder til PCR rør til lynfrysning

  • • 3 PCR rør til blindprøver pr. biopsi

  • • 1 PCR rør pr. forventet biopsi

  • • 1 rundbundet glas i stativ (til biopsimedie, ca. 0,5-1,0 ml op hældes inden belysning)

  • • 1 rundbundet glas i stativ (til olie til olieoverlejring, kun ved PCR)

  • • 2 hvide plasticposer

  • • 1 holdepipette pr. patient

  • • 1 biopsipipette pr. forventet biopsi

  • • 1 PCR rør til Proteinase K mix (kun ved PCR)

  • • 1 rør med PCR vand (tages fra fryseren) (kun ved PCR)

  • • Patient labels

  • • 1 handlingspipette ca. 250 µm til håndtering af blastocyster

 

Desuden skal der i sterilbænken altid forefindes en tusch til mærkning af skåle, pasture plastpipetter, pipette til 0-10µl, pipette til 10-100 µl samt pipettespidser til alle pipetter, ekstra PCR rør, ekstra 6 cm petriskåle, ekstra biopsi pipetter, ekstra holdepipetter (Alt udstyr skal være UV belyst før det må benyttes)

 

Mærkning af utensilier lige inden biopsitagningen

Al håndtering foregår med handsker, mundbind, OP-kittel og hårnet på

  • • Patientens PCR-rack påføres med permanent marker patientens navn og CPR-nr på bund og låg

  • • 2 petriskåle (6 cm) pr. forventet biopsi; En biopsi-skål og en skylle-skål, mærkes med patientens initialer og CPR-nr på låg

  • • Desuden skal både skylle- og biopsiskålens låg mærkes med nummer på blastocysten

 

Klargøring, ophældning og afpipettering af medier samme dag

På selve dagen skal følgende medier ophældes/afpipetteres (al håndtering foregår med handsker, hårnet, OP-kittel og mundbind på)

  • • Proteinase K mix fremstilles af 2 µL Proteinase K (7 µL er afpipetteret i PCR-rør og står i køleskabet) og 198 µL PCR-rent vand i et PCR rør. Mærkes ”PK mix” (holdbar i én dag). PCR-rent vand skal være UV belyst inden brug. OBS Fremstilling af PK mix KUN ved PCR metode.

  • • Der hentes et spidsglas med Gamete Buffer og ved NGS også et spidsglas med PBS medie i køleskabet

  • • 1 biopsiskål laves pr. biopsi med 2 dråber Gamete Buffer: 1 dråbe på 25 µl til biopsi og 1 mindre dråbe til at skylle blastocysten i og overlejres med forvarmet olie, opbevares varmt ind til brug (bord indkubator i kold bænk – UDEN CO2)

  • • Skylle-skål (fremstilles umiddelbart før hver biopsi, i den kolde bænk): med 3 dråber (25 µl) biopsimedie, der forbindes til én lang dråbe. Står klar i den kolde flowbænk indtil brug.

  • • PCR røret til biopsien mærkes på låget og siden med den biopterede blastocysts nummer (fra formatex)

  • • PCR rør til blindprøver mærkes på låget og siden med blastocystens nummer, samt med henholdsvis 1 prik, 2 prikker og 3 prikker

  • • VED PCR: I de mærkede PCR rør skal der til PCR afpipetteres 2,5 µl PK mix – både i rør til blindprøver og biopsier

  • • Centrifuger kort i mikrofuge (ca. 15 sek.). Kontroller at alt medie er slynget ned og at der ingen bobler er

  • • VED NGS: I de mærkede PCR rør skal der til NGS afpipetteres 2,5 µl PBS buffer- både i rør til blindprøver og biopsier

  • • Centrifuger kort i mikrofuge (ca. 15 sek.). Kontroller at alt medie er slynget ned og at der ingen bobler er

  • • De klargjorte PCR rør lukkes og placeres i rack’et indtil brug

 

Vedrørende copilot opgaver

 

  • • Fordeling mellem pilot og copilot ved bioptering afhænger af dagsprogrammet og aftales mellem pilot og copilot. Som minimum er copiloten med under selve biopsitagning, hvor copiloten skyder med laser efter pilotens anvisning. Pilot og copilot bestræber sig, i samarbejde under biopsitagning, at få cellerne frigjort så intakte som muligt. Desuden bestræber vi os at tage biopsier med ca. 5-10 celler (underforstået at i hvert fald mindre end 4 celler er formentligt for lidt).

 

     

Klargøring af Integra 3 mikromanipulation og Saturn 5 laser

Det anbefales at læse og følge de af leverandørerne udleverede manualer til udstyret.

Før brug af laserudstyr kan der udføres en Laser alignment

  • • Vælg ”laser settings”

  • • Placer indstillingsskålen under mikroskop med dråberne ud af lysvejen og sluk mikroskoplyset

  • • Brug 40xlaserobjektivet

  • • Sluk mikroskoplyset

  • • Følg herefter punkterne angivet på skærmen

  • • Skru på mikroskopets fokusskruen indtil laserlyset er i fokus (bliver ikke rigtig skarpt)

  • • Klik på midten af lysfeltet, hvorefter lysfeltet finder et uvilkårligt nyt sted på skærmen. Klik igen så nøjagtig i midten af lysfeltet som muligt, klik på ”next” og gentage proceduren indtil laser alignment feltet viser ”finish”. Klik dig ud af ”laser sættings” mode.

Efter laser alignment skal mikroskop og mikromanupulatorer indstilles.

  • • Sørg for at de røde håndtag hænger lige ned

  • • De grønne indikationsprikker på Integra’ens display skal være midt på displayet, som indikation for at finjusteringshåndtagene er placeret centralt

  • • Sæt holde- og biopsi-pipetterne i, drej dem ind i lysfeltet og placer dem centralt.

  • • Med objektiv x4 (+spacer) Indstilles pipetterne med finjustering til de står skarpt. Skru evt .pipetterne en smule op med de røde håndtag

  • • Brug en indstillingsskål (en lille petriskål med en dråbe gamet buffer overlejret med olie). Stil skarpt på dråbens kant og sænk pipetter ned i dråben. Skru på de røde håndtag, indtil pipetterne lige netop ikke rører bunden længere. Skrue derefter, hvis nødvendigt, på mikroskopets fokusskrue indtil pipetterne står skarpe

  • • Indstil pipetterne med finjustering til de står skarpt (objektiv x 10) Sug lidt medie op i holdepipetten. Sørg for at pipetterne er i balance.

  • • Løft pipetterne, og Integra’en er klar til brug

 

Håndtering lige inden biopsi

  • • Sørg for at ALLE utensilier og medier er klar

  • • Den i forvejen annoterede slide med de udvalgte blastocyster tages ud af EmbryoScopet, og placeres i bord incubator i den varme flowbænk (MED CO2)

  • • I kold bænk: Klargør den ønskede skylleskål med biopsi medie – kontroller at nummeret stemmer overens med den blastocyst, der skal biopteres

  • • I kold bænk: Første blind laves. I PCR rør mærket med en prik afsættes ca. 1µl biopsimedie taget fra den nederste del af den aflange dråbe

  • • I kold bænk: Coat handlings pipetten med gamet buffer

  • • Vitrifikationsskål mærkes med navn, CPR.nr og V efterfulgt af blastocystnummer i Formatex og placeres i bordincubator i varm bænk.

  • • Tag biopsiskålen fra incubator i den kolde bænk, og placer den under mikroskopet i den varme bænk

  • • Kontroller at mærkning af biopsiskålen er korret, og noter det aktuelle blastocysts nr på låget

  • • Tag Sliden ud af inkubatoren, og skyl den udvalgte blastocyst i skylledråben i biopsiskålen og overfør den til biopsidråben i biopsiskålen

  • • Sæt sliden tilbage i bordinkubatoren

  • • Udfør biopsi på den udvalgte blastocyst

 

Bioptering

  • • Sæt biopsiskålen under mikroskopet. Find og fokuser på blastocysten ved x10 objektiv

  • • Sænk forsigtigt pipetterne, og kontroller at de er i balance og begge pipetter i præcis samme fokus plan

  • • Håndter ved x 10 objektiv blastocysten til den er placeret optimalt (ICM længst væk fra det sted, hvor biopsien tages. ICM må ikke være ud for holdepipetten), og sug den fast på holdepipetten

  • • Skift til laser objektiv

  • • Stil skarpt på blastocysten og holdepipetten

  • • Flyt forsigtigt blastocysten, hvis det skønnes nødvendigt for en optimal placering.

  • • Stil skarpt på biopsipipetten.

    • • Tag biopsien

    • • Skyd hul på zona med laser (9-14 µm)

    • • Skub til blastocysten således at blastocysten kollapser og der bliver et område med frit periviteline space, hvor der kan skydes i zona og laves en kanal.

    • • Der skydes en kanal med 14 µm laser

    • • Biopsipipetten føres gennem zona og der suges TE celler op i biopsipipetten

    • • Pipetten trækkes forsigtig ud af zona og celler skydes fri med laser 14-16 um (der kan også afsluttes mekanisk, vha. holdepipetten)

  • • Pust biopsien forsigtigt ud.

  • • Pust blastocysten af holdepipetten

  • • Kontroller hvor stor biopsien er

 

Håndtering efter biopsi

  • • Når biopsien er taget sættes biopsiskålen under mikroskopet i den varme bænk

  • • Blastocysten skylles og placeres i vitriskålen, som tilhører denne blastosyst. Vitriskålen anbringes i bordpladeinkubator i den varme bænk.

  • • Biopsiskålen med TE biopsien flyttes til mikroskopet i den kolde bænk

  • • Kontroller at den skylleskål, der står klar i bænken er korrekt mærket med det aktuelle blastocyst nummer

  • • Med den for-coatede handlings pipette skal biopsien flyttes fra biopsiskålen til skylleskålen

  • • Backload en lille smule biopsi medie i pipetten

  • • Løft forsigtigt biopsien ud af biopsiskålen, og afsæt den med så lidt medie som muligt i toppen af den aflange skylle dråbe

  • • Tøm resten af mediet fra pipetten ud ved siden af den aflange dråbe

  • • Sug lidt frisk medie op i pipetten og tøm det ud ved siden af den aflange dråbe (dette gøres 2 gange)

  • • Backload med lidt frisk medie, flyt forsigtigt biopsien ca en ½ centimeter nedad i den lange dråbe og afsæt den med så lidt medie som muligt

  • • Tøm resten af mediet fra pipetten ud ved siden af den aflange dråbe

  • • Sug lidt frisk medie op i pipetten og tøm det ud ved siden af den aflange dråbe (dette gøres 2 gange)

  • • Backload med lidt frisk medie, flyt forsigtigt biopsien ca en ½ centimeter nedad i den lange dråbe og afsæt den med så lidt medie som muligt

  • • Tøm resten af mediet fra pipetten ud ved siden af den aflange dråbe

  • • Sug lidt frisk medie op i pipetten og tøm det ud ved siden af den aflange dråbe, gentag 2 gange

  • • Sug ca 0,5 µl medie op fra røret (pkmix eller PBS)

  • • Sug biopsien op i pipetten med ca 1 µl biopsimedie

  • • Løft pipetten skub skylleskålen væk, og tag det klargjorte PCR-rør, kontroller at røret er korrekt mærket

  • • Afsæt forsigtig biopsi og den ønskede volumen biopsimedie i PCR-røret. Undgå luft (total volumet i rør skal være ca.3,5 µl)

  • • Tøm pipetten udenfor den aflange skylledråbe og kontroller at biopsien ikke kommer med ud.

  • • Lav to blindprøve med ca. 1 µl biopsimedie fra den nederste del af den aflange skylledråbe

  • • Slyng rørene ca. 15-20 sekunder i mikro centrifugen. Hvis der er luftbobler i PCR-røret slynges de længere tid.

  • • Ved PCR skal der overlejres med 25 µl olie, centrifugeres kort efterfølgende

  • • Placer røret i holderacket til lynfrys

  • • Når alle patientens TE-biopsier er overført til PCR-rør (+ 3 blindprøver per biopsi), lynfryses racket ved at holde det i flydende kvælstof i ca 30 sekunder

  • • Efter lynfrys overføres rørene til patientens rack – kontroller at navn og personnummer stemmer overens

  • • Racket pakkes i en hvid plasticpose (UV belyst), og der bindes knude på posen. Pakkes i endnu en belyst pose, hvorpå patientens navn og CPR nummer påføres. Bind knude på posen

Posen med racket sættes i fryser i laboratoriet, og afventer afhentning

 

 

 

Afsending af biopsier fredag mellem 8.30 og 9.00

  • Det er PGT’bioanalytikernes/biolog ansvar, at der er forberedt til afhentning af de aktuelle biopsier, dvs. at kopi af dyrkningsskema og kopi af observationsskema er lagt i chartek og anbragt i charteklommen på køleskabsdøren parat til afhentning fredag morgen mellem 8.30 og 9.00.

 

  • For selve afhentningen hænger SOP’en på køleskabsdøren.

  • Når ugearbejdsskema bliver lagt, vil serviceringspost om fredagen også omfatte afsending af biopsiprøverne. Dvs. man vil altid kan se på arbejdsskemaet, hvis ansvar det er om fredagen at få sendt biopsierne.

 

Papirgang efter bioptering

  • • Blastocysterne annoteres i Vieweren og overføres til Formatex.

  • • Udfør PGT i Formatex

  • • Udfyld statestikark i PGT-mappen

  • • Efter vitrificering af de biopterede blastocyster, fryses de i Formatex.

  • • Vitrifikationsskemaerne sættes i mappen ”PGT patienter afventer svar”

  • • Tag kopi af dyrkningsskema og oberservationsskema til Molekylærbiologerne, når alle blastocyster er biopteret. Sættes i gult chartek ophængt ved klargøringsbord.

  • • Chartek med dyrkningsskemaer mm lægges tilbage i journalen, når vi har biopteret alle egnede blastocyster

  • • Send brev med resultater til pt. i E-BOKS via Sikker Mail, brevet ligger på K-drevet under laboratorium ”Brev PTG-biopsi” Husk at ændre dato og navn i brevet og tilføj resultaterne inden det vedhæftes.

      • • Vælg Ny mail og skriv ”Resultat af behandling i emnefeltet”

      • • Skriv: ”Se vedhæftede brev ang. resultatet af behandlingen af æggene” i mailen og slet evt. eget navn i signatur

      • • Vedhæft det udfyldte brev

      • • Vælg Send Sikkert og indtast cpr.nr. og vælg Tjek, hvis det bliver grønt kan mailen sendes.

 

 

Afslutning af PGT-behandling i Formatex

Frisk cyklus for biopsitagning

Når vi har fået prøvesvar og noteret det på dyrkningsskema, vitrifikationsskema og statistikark, skal behandlingen afsluttes i Formatex, enten med ”ingen æg til planlagt totalfrys”, ”totalfrys (PGT)”, eller ”ingen raske æg (PGT)”.

Sidste punkt før selve FER-behandling vil altså være at tage sig af prøvesvar og at afslutte behandlingen i Formatex.

FER behandling

Ved FER behandling vil det være os, der afslutter behandlingen, hvis der ikke er æg til transferering. Afslutningsårsagen er ”Æg uegnede til transferering/vitrifikation”