PGT – Klargøring, bioptering og tubing

Formål

At sikre, at korrekt klargøring af medier og utensilier forud for bioptering og efterfølgende præparering af biopterede celler sker i overensstemmelse med Fertilitetsenheden, Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.
 

Definition af begreber

PGT (Præimplantations Genetisk Testning) indebærer befrugtning vha. ICSI, dyrkning til blastocyststadie og efterfølgende bioptering af trofektoderm (TE) celler. Biopsien undersøges for arveligt betingede sygdomme på Afdeling for Molekylær Diagnostik, hvorved den aktuelle blastocyst erklæres enten egnet eller uegnet til ægoplægning. Der anvendes PCR (Polymerase Chain Reaction) eller NGS (Next Generation Sequencing) som analysemetode.

Beskrivelse

 
Ansvar

Laboratorielederen har det overordnede ansvar for, at der informeres og undervises i proceduren. I den daglige drift er det laboratoriepersonalets ansvar at opretholde den nødvendige rutine der kræves for, at proceduren kan efterleves i praksis.

Renlighed i PGT-laboratoriet

Af hensyn til risiko for kontaminering skal al omgang i PGT-laboratoriet foregå iført handsker. Under PGT-procedurer skal man være iført hårnet, mundbind og OP-kittel med sterile handsker trukket hen over kitlens ærmer.

Fremgangsmåde

Klargøring dagen før:

Klargøring af medier

Dagen før bioptering skal følgende medier stilles til ækvilibrering i CO₂ inkubatoren i PGT-laboratoriet. Al håndtering af medier foregår iført handsker:

1. 1. 1 ubrudt flaske olie (60 ml pr. 8 forventede biopsier eller 100 ml pr. 15 forventede biopsier).

1. 2. 1 stk. 3 cm petriskål til vitrifikation pr. forventet biopsi (to dråber à ca. 25 µl CSCM dyrkningsmedie overlejret med olie).

Klargøring og mærkning af utensilier

1. 3. Utensilier til alle aktuelle patienter gøres klar dagen før.

1. 4. Alle utensilier skal anbringes i bænk og UV belyses i 10 minutter.

Pr. patient skal følgende utensilier klargøres:

• • 1× 6 cm petriskål til indstilling af pipette – Anvendes til alle patienter.

• • 2× 6 cm petriskåle pr. forventet biopsi (biopsi og skyl).

• • 1 handling pipette (133 – 135 µm pipette) pr. forventet biopsi.

• • 1 rack til PCR-rør under ”handling” processen og et rack pr. ny dag 5 patient.

• • 1 holder til PCR rør til lynfrysning.

• • 3 PCR rør til blindprøver pr. biopsi.

• • 1 PCR rør pr. forventet biopsi.

• • 1 rundbundet glas i stativ (til biopsimedie, ca. 0,5 – 1,0 ml op hældes inden belysning). Dette bruges til flere patienter.

• • 1 rundbundet glas i stativ (til olie til olieoverlejring, kun ved PCR).

• • 2 hvide plastikposer.

• • 1 holdepipette pr. patient.

• • 1 biopsipipette pr. forventet biopsi.

• • 1 PCR rør til Proteinase K mix (kun ved PCR).

• • 1 rør med PCR vand (kun ved PCR) – Tages fra fryseren og må højst anvendes 1 uge efter anbrud.

• • Patient labels.

• • 1 handlingspipette ca. 250 µm til håndtering af blastocyster.

Desuden skal der i flowbænken altid forefindes en tusch til mærkning af skåle, pasteur plastpipetter, 0 – 10 µl og 10 – 100 µl pipetter, samt tilhørende pipettespidser, ekstra PCR rør, ekstra 6 cm petriskåle, ekstra biopsi pipetter, ekstra holdepipetter (alle utensilier skal være UV belyst før det må benyttes).

Klargøring på dagen:

Mærkning af utensilier lige inden bioptering

Al håndtering foregår iført handsker, mundbind, OP-kittel og hårnet.

1. 5. Patientens navn og CPR-nummer påføres på bunden og låget af patientens PCR-rack med en permanent marker.

1. 6. 1× 6 cm petriskåle (biopsiskål) pr. forventet biopsi mærkes med patientens navn, CPR-nummer og blastocyst nummer på låget.

2. 7. 1× 6 cm petriskåle (skylleskål) pr. forventet biopsi mærkes med blastocyst nummer på låget.

Klargøring, ophælding og afpipettering af medier samme dag

Al håndtering foregår iført handsker, hårnet, OP-kittel og mundbind.

På selve dagen skal følgende medier ophældes/afpipetteres:

OBS Fremstilling af PK mix KUN ved PCR-metode | PCR-rent vand skal være UV belyst inden brug

1. 8. Proteinase K mix fremstilles af 2 µl Proteinase K (PCR rør i køleskabet indeholdende 7 µl proteinase K) og 198 µl PCR-rent vand, som blandes i et PCR rør og mærkes ”PK (mix)” (holdbar i én dag).

1. 9. I køleskabet hentes et spidsglas med MHM medie – til NGS skal der også bruges et spidsglas med PBS buffer.

2. 10. 1 biopsiskål laves pr. biopsi med 2 dråber MHM medie:

   1. 10.1. 1 dråbe på 25 µl til biopsi og 1 mindre dråbe til at skylle blastocysten i.

   2. 10.2. Overlejrer med forvarmet olie og opbevar skålen i i bordinkubator i den kolde bænk – UDEN CO₂ – inden brug.

3. 11. Skylleskål (fremstilles umiddelbart før hver biopsi, i den kolde bænk):

   1. 11.1. 3 dråber (25 µl) biopsimedie forbindes til én lang dråbe.

   2. 11.2. Skålen står i den kolde bænk indtil brug.

4. 12. PCR-røret til biopsien mærkes på låget og siden med den biopterede blastocysts nummer (fra Formatex).

5. 13. PCR-rør til blindprøver mærkes på låget og siden med blastocystens nummer, samt med henholdsvis 1 prik, 2 prikker og 3 prikker.

• • • VED PCR: I de mærkede PCR-rør skal der afpipetteres 2,5 µl PK mix – både i rør til blindprøver og biopsi. De klargjorte PCR-rør lukkes og placeres i rack’et indtil brug.

  • • VED NGS: I de mærkede PCR-rør skal der afpipetteres 2,5 µl PBS buffer – både i rør til blindprøver og biopsi. De klargjorte PCR-rør lukkes og placeres i rack’et indtil brug.

1. 14. Centrifuger ca. 5 sekunder og kontroller, at alt medie er slynget ned og at der ikke er bobler.

Co-pilotens opgaver

Fordeling mellem pilot og co-pilot afhænger af dagsprogrammet og aftales indbyrdes. Som minimum er co-

piloten med til biopteringen og affyrer laseren efter pilotens anvisning. Pilot og co-pilot bestræber sig, i

samarbejde under bioptering om at få cellerne frigjort så intakte som muligt og tage en biopsi med ca. 5 – 10

TE celler.

Klargøring af Integra 3 mikromanipulation og Saturn 5 laser

Opstart af udstyr

1. 1. Tænd først PC’en.

1. 2. Vent til PC’en er færdig med at starte op.

1. 3. Tænd for mikroskop og laser på kontakten på væggen.

Laser

Før brug af laseren skal det kontrolleres, at den er korrekt justeret. Er laseren ikke korrekt justeret skal der udføres en laser justering:

1. 15. Vælg ”laser settings”.

1. 16. Placer indstillingsskålen under mikroskopet.

2. 17. Brug 40× laser objektivet.

3. 18. Sluk mikroskoplyset og fokuser på laseren (bliver ikke rigtig i fokus).

4. 19. Følg herefter punkterne angivet på skærmen.

5. 20. Klik på midten af lysfeltet, hvorefter lysfeltet finder et uvilkårligt nyt sted på skærmen. Klik igen så nøjagtig i midten af lysfeltet som muligt, klik på ”next” og gentag proceduren indtil laser alignment feltet viser ”finish”. Klik dig ud af ”laser settings” mode.

Mikroskop og Integra

Efter laser justering skal mikroskop og mikromanipulatoren indstilles.

1. 21. Sørg for, at de røde håndtag hænger lige ned.

1. 22. Det er optimalt, når de grønne indikationsprikker på Integra displayet er i midten på displayet, som indikation for at finjusteringshåndtagene er placeret centralt.

2. 23. Sæt holde- og biopsi-pipetterne i, drej dem ind i lysfeltet og placer dem centralt.

3. 24. Med objektiv 4× (+spacer) indstilles pipetterne.

4. 25. Brug indstillingsskålen (lille petriskål med en dråbe MHM medie overlejret med olie), fokuser på dråbens kant og sænk pipetterne ned i dråben.

5. 26. Skru på de røde håndtag, så pipetterne lige netop ikke rører bunden. Fokuser på pipetterne.

6. 27. Indstil pipetterne med finjustering til de står skarpt (objektiv 10×). Sug lidt medie op i holdepipetten og sørg for, at vaskeoverfladen er stabil i pipetten.

7. 28. Løft pipetterne op.

8. 29. Integra’en er klar til brug.

Håndtering lige inden biopsi

1. 30. Sørg for, at ALLE utensilier og medier er klar.

1. 31. Tænd for CO₂ i den varme bænk.

2. 32. Flyt den slide med de relevante blastocyster fra EmbryoScopet til bordinkubatoren i den varme bænk.

3. 33. I den kolde bænk gøres følgende:

   1. 33.1. Klargør skylleskål med biopsi medie – kontroller, at nummeret stemmer overens med den blastocyst, der skal biopteres.

   2. 33.2. Første blindprøve laves. I PCR røret mærket med en prik afsættes ca. 1 µl biopsimedie taget fra den nederste del af den aflange dråbe.

   3. 33.3. Coat handling pipetten med MHM medie.

4. 34. En vitrifikationsskål mærkes med navn, CPR-nummer og V efterfulgt af blastocystnummer i Formatex. Skålen stilles i bordinkubatoren i den varme bænk.

5. 35. Biopsiskålen flyttes fra bordinkubatoren i den kolde bænk og placeres under mikroskopet i den varme bænk.

6. 36. Kontroller, at mærkning af biopsiskålen er korrekt, og noter det aktuelle blastocystnummer på låget.

7. 37. Tag sliden ud af bordinkubatoren og flyt den udvalgte blastocyst til skylledråben i biopsiskålen. Skyl blastocysten og overfør den derefter til biopsidråben i samme skål.

8. 38. Sæt sliden tilbage i bordinkubatoren.

9. 39. Udfør bioptering af blastocysten.

Bioptering

1. 40. Sæt biopsiskålen under mikroskopet og fokuser på blastocysten med 10× objektivet.

1. 41. Sænk forsigtigt pipetterne og kontroller, at begge pipetter er i samme plan.

2. 42. Placer blastocysten så ICM er længst væk fra, hvor biopsien skal tages, samtidig med at ICM ikke må være ud for holdepipetten. Sug blastocysten fast med holdepipetten.

3. 43. Skift til laser objektivet.

4. 44. Fokuser på blastocysten og holdepipetten.

5. 45. Er blastocysten ikke indenfor det område (markeret på computer skærmen), hvor laseren er justeret kan den flyttes forsigtigt.

6. 46. Fokuser på biopsipipetten.

7. 47. Skyd hul på zona med laseren (9-14 µm).

8. 48. Skub til blastocysten, så den kollapser og der bliver et område med frit perivitelline rum.

9. 49. Affyr nu laseren på zona og lav en kanal med laseren (14 µm).

10. 50. Biopsipipetten føres gennem zona og der suges TE celler op i biopsipipetten.

Pipetten trækkes forsigtig ud af zona og celler skydes fri med laseren (14-16 µm). Undgå at affyre laseren på TE cellerne, men sigt på områder mellem cellerne. Der kan også afsluttes mekanisk, vha. holdepipetten.

1. 51. Biopsien og blastocysten frigives begge i biopsiskålen.

2. 52. Det tilstræbes, at biopsien indeholder 5-10 TE celler. Størrelsen på biopsien vurderes og er den lille noteres det på observationsskemaet.

Problem: Blastocysten er hatched og kollapser, når den flyttes til biopsiskålen.

Løsning: Lad blastocysten re-ekspandere i MHM i biopsiskålen ved 37°C (ingen CO₂). Sørg for, at blastocysten opbevares i MHM mediet i så kort tid som det er mulig. Det vil være bedst, hvis biopsien kan tages indenfor 10 – 30 minutter.

Håndtering efter bioptering

1. 53. Når biopsien er taget, flyttes biopsiskålen under mikroskopet i den varme flowbænk.

1. 54. Blastocysten skylles og placeres i vitrifikationsskålen, som tilhører denne blastocyst. Vitrifikationsskålen anbringes i bordpladeinkubatoren i den varme flowbænk.

2. 55. Biopsiskålen med biopsien flyttes til mikroskopet i den kolde flowbænk.

3. 56. Kontroller, at den skylleskål, der står klar i bænken er korrekt mærket med det aktuelle blastocyst nummer.

4. 57. Med den for-coatede handling pipette flyttes biopsien fra biopsiskålen til skylleskålen.

5. 58. Backload en lille smule biopsi medie i pipetten.

6. 59. Sug forsigtigt biopsien og afsæt den med så lidt medie som muligt i toppen af den aflange skylledråbe.

7. 60. Tøm resten af mediet fra pipetten ud ved siden af den aflange dråbe.

8. 61. Sug lidt frisk medie op i pipetten og tøm det ud ved siden af den aflange dråbe, gentag 2 gange.

9. 62. Backload med lidt frisk medie, flyt forsigtigt biopsien ca. ½ centimeter nedad i den lange dråbe og afsæt den med så lidt medie som muligt.

10. 63. Tøm resten af mediet fra pipetten ud ved siden af den aflange dråbe.

11. 64. Sug lidt frisk medie op i pipetten og tøm det ud ved siden af den aflange dråbe, gentag 2 gange.

12. 65. Backload med lidt frisk medie, flyt forsigtigt biopsien ca. ½ centimeter nedad i den lange dråbe og afsæt den med så lidt medie som muligt.

13. 66. Tøm resten af mediet fra pipetten ud ved siden af den aflange dråbe.

14. 67. Sug lidt frisk medie op i pipetten og tøm det ud ved siden af den aflange dråbe, gentag 2 gange.

15. 68. Sug lidt medie op i pipetten.

16. 69. Sug ca. 0,5 µl medie op fra røret (PK mix eller PBS).

17. 70. Sug biopsien op i pipetten med ca. 1 µl biopsimedie.

18. 71. Afsæt forsigtig biopsi og den ønskede volumen biopsimedie i PCR-røret. Undgå luft (volumen i PCR-røret bør være ca. 3,5 µl).

19. 72. Tøm pipetten udenfor den aflange skylledråbe og kontroller, at biopsien ikke kommer med ud.

20. 73. Lav to blindprøver med ca. 1 µl biopsimedie fra den nederste del af den aflange skylledråbe

21. 74. Slyng rørene ca. 5 sekunder i mikro-centrifugen. Hvis der er luftbobler i PCR-røret slynges de længere tid.

22. 75. Ved PCR skal der overlejres med 25 µl olie og centrifugeres kort efterfølgende.

23. 76. Placer PCR-rørene i holde-rack’et til lynfrys

    1. 76.1. Når alle patientens biopsier er overført til PCR-rør (+ 3 blindprøver pr. biopsi), lynfryses

rack’et ved at holde det i flydende kvælstof i ca. 30 sekunder.

1. 1. 76.2. Efter lynfrys overføres rørene til patientens rack – kontroller at navn og CPR-nummer

stemmer overens.

1. 1. 76.3. Rack’et pakkes i en hvid plasticpose (UV belyst) og der bindes knude på posen. Denne

pakkes i endnu en UV belyst pose, hvorpå patientens navn og CPR-nummer påføres. Bind knude på posen.

1. 77. Posen med rack’et sættes i fryseren i laboratoriet indtil afhentning.

Afhentning af biopsier fredag mellem 8.30 og 9.00

1. 78. Det er laboratoriets ansvar, at alle relevante dokumenter med tilknytning til de aktuelle biopsier er klar til afhentning fredag morgen mellem 8.30 – 9.00.

• • • Kopi af dyrkningsskema

  • • Kopi af observationsskema

1. 79. For selve afhentningen hænger SOP’en på væggen ved klargøringsområdet.

2. 80. Serviceringsposten om fredagen omfatter afsending af biopsiprøverne.

Papirgang efter bioptering

1. 81. Blastocysterne annoteres i Vieweren og overføres til Formatex.

1. 82. Udfør PGT i Formatex.

2. 83. Udfyld statistikark i PGT-mappen.

3. 84. Efter vitrifikation af de biopterede blastocyster, fryses de i Formatex.

4. 85. Tag en kopi af dyrkningsskema og observationsskema til molekylærbiologerne, når alle relevante blastocyster er biopteret. Kopierne sættes i det gule chartek ophængt ved klargøringsbordet.

5. 86. Chartek med dyrkningsskemaer lægges i kurven oven på varmeskabet.

6. 87. Send brev med resultater til patienten i Digital Post via Sikker Mail

   1. 87.1. Vælg ”Ny mail” og skriv ”Resultat af behandling” i emnefeltet.

   2. 87.2. Vælg signatur med PGT-brev og udfyld det.

   3. 87.3. Vælg Send Sikkert og indtast CPR nummer og vælg ”Tjek”. E-mailen kan sendes, hvis det

bliver grønt.

Afslutning af PGT-behandling i Formatex

Frisk PGT-cyklus

1. 88. Er der ikke nogle blastocyster, som kan biopteres skal cyklus afsluttes med ”Æg uegnede til biopsi (PGT)”.

1. 89. Når prøvesvar fra molekylærbiologerne modtages, skal det noteres på dyrkningsskemaet og på statistikarket. Dette skal gøres af to personer.

2. 90. Behandlingen afsluttes i Formatex enten med ”totalfrys (PGT)” eller ”ingen raske æg (PGT)” afhængig af udfaldet.

3. 91. Er der blastocyster, som skal rebiopteres lægges der en ”Husk rebiopsi” seddel i chartekket med dyrkningsskemaet.

FET behandling

Ved FET behandling afslutter laboratoriet behandlingen, hvis der ikke er æg til transferering. Afslutningsårsagen er ”Æg uegnede til transferering/vitrifikation”.

Risikovurdering

Ophældt biopsimedie kan anvendes til flere patienter

• • Der anvendes altid en ny pipette til klargøring af skylleskåle for at undgå kontaminering af DNA fra patientens blastocyster, hvilket ville kunne resultere i en fejldiagnose.

• • Baseret på ovenstående er det vurderet, at biopsimediet i det rundbundet glas kan anvendes til flere patienter.

Holdbarhed på biopsimedie

• • Ifølge producenten skal biopsimediet anvendes inden 7 dage efter åbning.

• • Biopsimediet anvendes udelukkende til at skylle cellerne fra biopsien inden der skal tubes og sendes til den molekylær diagnostiske test.

• • Blastocysten er på intet tidspunkt i kontakt med biopsimediet.

• • Holdbarheden af biopsimediet er underordnet i forhold til resultatet af de molekylær diagnostiske test.

• • Baseret på ovenstående er det vurderet, at holdbarheden af biopsimediet kan overskrides.

• • Det ophældte biopsimedie kan anvendes i 7 dage, hvorefter det skal kasseres.