Ignorer kommandoer på båndet
Gå til hovedindhold

Testning af renhed i PGT-laboratoriet

 

Formål

At sikre, at korrekt testning af renhed i PGT-laboratoriet sker i overensstemmelse med Fertilitetsenheden Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.
 

Beskrivelse

 
Baggrund, anvendelse og gyldighed 

Proceduren omfatter testning af renhed i PGT laboratoriet.

 

Ansvar

Laboratorielederen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonalet ansvarlig for, at nye medarbejdere informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personlig ansvarlig for, at proceduren efterleves i praksis.

 

Beskrivelse

 

I forbindelse med opstart af PGT laboratoriet

 

Da der laves blindprøver i forbindelse med tubing af hver biopsi, skal denne procedure kun udføres, såfremt man finder en DNA forurening i forbindelse med en analyse. I så fald skal proceduren udføres, som beskreven nedenfor.

 

Til testning af renhed i PGT-laboratoriet fremstilles 20 blindprøver i PCR rør med samme medie som ved biopsi; 10 blindprøver med PK mix og 10 prøver med PBS i. Prøverne analyseres af Afsnit for Molekylær Diagnostik.

 

Apparatur, utensilier og reagenser

 

Apparatur

Utensilier

Flowbænk

Mikrocentrifuge

 

20 stk. PCR-rør - placeres evt. i en frysekasse

1 stk. rundbundet glas i stativ

1 stk. spidsglas i stativ

2 stk. 6 cm petriskåle

20 µl pipette + pipettespidser

100 µl pipette + pipettespidser

Denuderingspipetter

1 stk. frysebakke mærket "Blindprøver" på bund og låg

1 ml vand, PCR Grade

MHM medie

PBS

1 flaske ubrudt olie

1 PCR rør med Proteinase K

3 stk. hvide plastik poser

OP-hue

Mundbind

Steril kittel

Sterile handsker

Permanent marker til mærkning af PCR-rør

 

Klargøring

  1. 1. Flowbænken (den kolde) i PGT-laboratorie indstilles til mode 4.

  2. 2. Flowbænken afvaskes med detergent 7X og sterilt vand.

 

Alle utensilierne stilles frem i den kolde flowbænk i PGT-laboratoriet dagen før og UV belyses 10 minutter.

 

Følgende må ikke UV belyses: MHM medie, PCR rør med Proteinase K, spidsglasglas med PBS og flasken med olie.

 

Døren til PGT-laboratoriet holdes lukket indtil blindprøverne skal fremstilles.

 

 

Fremgangsmåde

Ved fremstilling af blindprøverne skal man være iført steril kittel, sterile handsker, mundbind og OP-hue.

 

1 uåbnet flaske olie, biopsimedie, PBS og Proteinase K hentes i køleskab på laboratoriet og tages med i PGT-laboratoriet.

 

Fremstilling af Proteinase K mix (PK mix)

  1. 3. 2 µl Proteinase K og 198 µl vand, PCR Grade blandes i 1 ml cryotube.

 

Fremstilling af blindprøver med Proteinase K mix (PK mix)

  1. 4. Olie (ca. 3ml - anvendes også til blindprøver med PBS) hældes op i et rundbundet glas.

  2. 5. MHM medie (ca. 2-3 µl - anvendes også til blindprøver med PBS) hældes op i et spidsglas.

  1. 6. 2,5 µl PK mix afpipetteres i 10 PCR-rør og centrifugeres kort i mikrocentrifugen.

  2. 7. Lav 2 dråber a 25 µl MHM medie i petriskålen.

  3. 8. 1 µl MHM medie overføres fra den ene dråbe til hvert PCR-rør med denuderingspipetten.

  4. 9. PCR-rør placeres i mikrocentrifugen igen.

  5. 10. Skyl denuderingspipetten i den anden dråbe imellem hver afpipettering.

  6. 11. Centrifuger kort når alle 10 blindprøver er fremstillet.

  7. 12. Der overlejres med 25 µl olie i hver PCR-rør.

  8. 13. PCR-rør placeres i frysekasse med entydig mærkning.

 

Frysekassen pakkes ind i de 2 plastik poser og opbevares ved -20 grader indtil de afhentes af Afsnit for Molekylær Diagnostik.

 

 

Fremstilling af blindprøver med PBS

  1. 14. Olie og MHM medie er hældt op fra tidligere.

  1. 15. 2,5 µl PBS afpipetteres i 10 PCR-rør og centrifugeres kort i mikrocentrifugen.

  2. 16. Lav 2 dråber a 25 µl MHM medie i petriskålen.

  3. 17. 1 µl MHM medie overføres fra den ene dråbe til hver PCR-rør med denuderingspipette.

  4. 18. PCR-rør placeres i mikrocentrifugen igen.

  5. 19. Skyl denuderingspipetten i den anden dråbe imellem hver afpipettering.

  6. 20. Centrifuger kort når alle 10 blindprøver er fremstillet.

  7. 21. PCR-rør placeres i frysekasse med entydig mærkning.

 

Hent frysekassen ud af -20 graders fryseren og placer PCR-rørene deri med entydig mærkning. Frysekassen pakkes ind i 2 plastik poser (den yderste pose kasseres og erstattes med nr. 3 plastik pose) og opbevares ved -20 grader indtil de afhentes af Afsnit for Molekylær Diagnostik.

 

I forbindelse med den løbende rutine

Så snart der påvises DNA i en blindprøve (uanset om i forbindelse med bioptering eller i de blindprøver til testning af renhed i laboratoriet) skal denne afvigelse give anledning til en evaluering af procedurerne/foranstaltningerne som skal sikre et DNA frit miljø i forbindelse med håndtering af biopsier.

 

Konsekvens

Hvis der viser sig at være DNA-forurening i en blindprøve, evalueres procedurerne/foranstaltninger, som skal sikre et DNA-rent miljø. Forureningen dokumenteres i en afvigerapport, hvor der også beskrives en korrigerende handling. Dette vil typisk resultere i øget opmærksomhed på steril påklædning og/eller DNA dekontaminering af relevante utensilier (UV belysning). Desuden kan en dybdegående rengøring af rummet, mikroskop, mikromanipulator, PC og tastatur komme på tale.