Ignorer kommandoer på båndet
Gå til hovedindhold

Testning af renhed i PGD-laboratoriet

 

Formål

At sikre, at korrekt testning af renhed i PGT-laboratoriet sker i overensstemmelse med Fertilitetsklinikken Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.
 

Beskrivelse

 
Baggrund, anvendelse og gyldighed 

Proceduren omfatter testning af renhed i PGT laboratoriet

 

Ansvar

Biologen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonale ansvarlig for, at nye medarbejder informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personligt ansvarligt for at proceduren efterleves i praksis.

 

Beskrivelse

 

I forbindelse med opstart af PGT laboratoriet

 

Da vi tager blindprøver løbende i forbindelse med tubing af hver biopsi, skal denne procedure kun udføres, såfremt man finder en DNA forurening (biopsifremmed DNA fundet ved analyse af biopsierne) i forbindelse med analyse af en biopsi.

I så fald skal proceduren udføres, som beskreven nedenfor.

 

Til testning af renhed i PGT-laboratoriet fremstilles 20 blindprøver i PCR rør med samme medie som ved biops; 10 blindprøver med PK mix og 10 prøver med PBS i. Prøverne analyseres af Afsnit for Molekylær Diagnostik.

 

Apparatur, utensilier og reagenser

 

Apparatur

Utensiler

Laf-bænk

Mikrofuge.

 

20 stk PCR-rør - placeres evt i en frysekasse

2 stk rundbundede glas i stativ

2 stk 6 cm petriskåle

20 µl pipettespidser

100 µl pipettespidser

denuderingspipetter

1 stk frysebakke mærket "Blindprøver" på bund og låg

20 µl pipette

100 µl pipette

1 ml Water, PCR Grade

Biopsimedie

PBS

1 flaske ubrudt olie

1 PCR rør med ProteinaseK

3 stk hvide plastposer

OP-hue

Mundbind

Steril kittel

Sterile handsker

Mikrofuge.

Tusch til mærkning af PCR-rør

 

Klargøring

  • • Laf-bænk(den kolde) i PGT-laboratorie indstilles i mode 4.

  • • Laf-bænken afvaskes med detergent 7X og sterilt H20

 

 

Alle utensilierne (bortset fra PCR rør med Proteinase K og spidsglasglas med PBS og flasken med olie) stilles frem i kold Lab-bænk i PGT-laboratoriet dagen før. Der hældes ca.1,5 ml biopsimedie op i et rundbuet glas i stativ og placeres ligeledes i bænken og alt UV belyses natten over.

Døren til PGT-laboratoriet lukkes.

PGT-laboratoriet er lukket indtil blindprøverne skal fremstilles.

 

 

Fremgangsmåde

Ved fremstilling af blindprøverne skal man være iført steril kittel, sterile handsker, mundbind og OP-hue.

 

1 uåbnet flaske Liquide Paraffin, biopsimedie, PBS og Proteinase K hentes i køleskab på laboratoriet og tages med i PGT-laboratoriet.

 

Fremstilling af Proteinase K mix (PK mix)

  • • 2 µl Proteinase K og 198 µl Water PCR Grade blandes i 1 ml cryotube.

 

Fremstilling af blindprøver med Proteinase K mix (PK mix)

  • • Liquide Paraffin (ca. 3ml; anvendes også til blindprøver med PBS) og biopsimedie (ca. 2-3 µl; anvendes også til blindprøver med PBS) hældes op i hvert sit rundbundede glas.

  • • 2,5 µl PK mix afpipetteres i 10 PCR-rør og centrifugeres kort i mikrofugen.

  • • Lav 2 dråber biopsimedie á 25 µl afpipetteres i petriskål.

  • • 1 µl biopsimedie overføres fra den ene dråbe til hvert PCR-rør med denuderingspipette.

  • • PCR-rør placeres i mikrofugen igen.

  • • Skyl denuderingspipetten i den anden dråbe imellem hver afpipettering

  • • Centrifuger kort, når alle 10 blindprøver er fremstillet

  • • Der overlejres med 25 µl Liquide Paraffin i hvert PCR-rør

  • • PCR-rør placeres i frysekasse med entydig mærkning.

 

 

Frysekassen pakkes ind i de 2 plastposer og opbevares ved -20 grader indtil de afhentes af Afsnit for Molekylær Diagnostik.

 

 

 

 

 

Fremstilling af blindprøver med PBS

  • • Liquide Paraffin (ca. 3ml; anvendes også til blindprøver med PBS) og biopsimedie (ca. 2-3 µl; anvendes også til blindprøver med PBS) er allerede hældt op i hvert sit rundbundede glas.

  • • 2,5 µl PBSx afpipetteres i 10 PCR-rør og centrifugeres kort i mikrofugen.

  • • Lav 2 dråber biopsimedie á 25 µl afpipetteres i petriskål.

  • • 1 µl biopsimedie overføres fra den ene dråbe til hvert PCR-rør med denuderingspipette.

  • • PCR-rør placeres i mikrofugen igen.

  • • Skyl denuderingspipetten i den anden dråbe imellem hver afpipettering

  • • Centrifuger kort, når alle 10 blindprøver er fremstillet

  • • PCR-rør placeres i frysekasse med entydig mærkning (se nedenfor).

 

 

Hent frysekassen ud af -20 graders fryseren og placer PCR-rørende deri med entydig mærkning

Frysekassen pakkes ind i 2 plastposer (den yderste pose kasseres og erstattes med nr. 3 plasticpose) og opbevares ved -20 grader indtil de afhentes af Afsnit for Molekylær Diagnostik.

 

I forbindelse med den løbende rutine

Så snart der påvises DNA i en blindprøve (uanset om i forbindelse med biopsi tagning eller i de blindprøver til testning af renhed i laboratoriet) skal denne afvigelse give anledning til en evaluering af procedurerne/foranstaltningerne, som skal sikre et DNA frit miljø i forbindelse med håndtering af biopsi.

 

 

Konsekvens

Hvis der viser sig at være DNA- forurening i en blindprøve, evalueres procedurerne/foranstaltninger, som skal sikre et DNA-rent miljø, nøje, og forureningen dokumenteres i en AFVIGERAPPORT, hvor der også beskrives en KORRIGERENDE HANDLING.

Dette vil typisk være større opmærksomhed vedrørende sterilt påklædning og/eller DNA dekontaminering af relevante utensilier (UV belysning).

Desuden kan en dybdegående rengøring af rummet inklusiv mikroskop, mikromanipulator, PC og tastatur komme på tale.