Testning af renhed i PGT-laboratoriet
Formål
At sikre, at korrekt testning af renhed i PGT-laboratoriet sker i overensstemmelse med Fertilitetsenheden Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.
Beskrivelse
Baggrund, anvendelse og gyldighed
Proceduren omfatter testning af renhed i PGT laboratoriet.
Ansvar
Laboratorielederen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonalet ansvarlig for, at nye medarbejdere informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personlig ansvarlig for, at proceduren efterleves i praksis.
Beskrivelse
I forbindelse med opstart af PGT laboratoriet
Da der laves blindprøver i forbindelse med tubing af hver biopsi, skal denne procedure kun udføres, såfremt man finder en DNA forurening i forbindelse med en analyse. I så fald skal proceduren udføres, som beskreven nedenfor.
Til testning af renhed i PGT-laboratoriet fremstilles 20 blindprøver i PCR rør med samme medie som ved biopsi; 10 blindprøver med PK mix og 10 prøver med PBS i. Prøverne analyseres af Afsnit for Molekylær Diagnostik.
Apparatur, utensilier og reagenser
Apparatur | Utensilier |
Flowbænk Mikrocentrifuge | 20 stk. PCR-rør - placeres evt. i en frysekasse 1 stk. rundbundet glas i stativ 1 stk. spidsglas i stativ 2 stk. 6 cm petriskåle 20 µl pipette + pipettespidser 100 µl pipette + pipettespidser Denuderingspipetter 1 stk. frysebakke mærket "Blindprøver" på bund og låg 1 ml vand, PCR Grade MHM medie PBS 1 flaske ubrudt olie 1 PCR rør med Proteinase K 3 stk. hvide plastik poser OP-hue Mundbind Steril kittel Sterile handsker Permanent marker til mærkning af PCR-rør |
Klargøring
1. Flowbænken (den kolde) i PGT-laboratorie indstilles til mode 4.
2. Flowbænken afvaskes med detergent 7X og sterilt vand.
Alle utensilierne stilles frem i den kolde flowbænk i PGT-laboratoriet dagen før og UV belyses 10 minutter.
Følgende må ikke UV belyses: MHM medie, PCR rør med Proteinase K, spidsglasglas med PBS og flasken med olie.
Døren til PGT-laboratoriet holdes lukket indtil blindprøverne skal fremstilles.
Fremgangsmåde
Ved fremstilling af blindprøverne skal man være iført steril kittel, sterile handsker, mundbind og OP-hue.
1 uåbnet flaske olie, biopsimedie, PBS og Proteinase K hentes i køleskab på laboratoriet og tages med i PGT-laboratoriet.
Fremstilling af Proteinase K mix (PK mix)
3. 2 µl Proteinase K og 198 µl vand, PCR Grade blandes i 1 ml cryotube.
Fremstilling af blindprøver med Proteinase K mix (PK mix)
4. Olie (ca. 3ml - anvendes også til blindprøver med PBS) hældes op i et rundbundet glas.
5. MHM medie (ca. 2-3 µl - anvendes også til blindprøver med PBS) hældes op i et spidsglas.
6. 2,5 µl PK mix afpipetteres i 10 PCR-rør og centrifugeres kort i mikrocentrifugen.
7. Lav 2 dråber a 25 µl MHM medie i petriskålen.
8. 1 µl MHM medie overføres fra den ene dråbe til hvert PCR-rør med denuderingspipetten.
9. PCR-rør placeres i mikrocentrifugen igen.
10. Skyl denuderingspipetten i den anden dråbe imellem hver afpipettering.
11. Centrifuger kort når alle 10 blindprøver er fremstillet.
12. Der overlejres med 25 µl olie i hver PCR-rør.
13. PCR-rør placeres i frysekasse med entydig mærkning.
Frysekassen pakkes ind i de 2 plastik poser og opbevares ved -20 grader indtil de afhentes af Afsnit for Molekylær Diagnostik.
Fremstilling af blindprøver med PBS
14. Olie og MHM medie er hældt op fra tidligere.
15. 2,5 µl PBS afpipetteres i 10 PCR-rør og centrifugeres kort i mikrocentrifugen.
16. Lav 2 dråber a 25 µl MHM medie i petriskålen.
17. 1 µl MHM medie overføres fra den ene dråbe til hver PCR-rør med denuderingspipette.
18. PCR-rør placeres i mikrocentrifugen igen.
19. Skyl denuderingspipetten i den anden dråbe imellem hver afpipettering.
20. Centrifuger kort når alle 10 blindprøver er fremstillet.
21. PCR-rør placeres i frysekasse med entydig mærkning.
Hent frysekassen ud af -20 graders fryseren og placer PCR-rørene deri med entydig mærkning. Frysekassen pakkes ind i 2 plastik poser (den yderste pose kasseres og erstattes med nr. 3 plastik pose) og opbevares ved -20 grader indtil de afhentes af Afsnit for Molekylær Diagnostik.
I forbindelse med den løbende rutine
Så snart der påvises DNA i en blindprøve (uanset om i forbindelse med bioptering eller i de blindprøver til testning af renhed i laboratoriet) skal denne afvigelse give anledning til en evaluering af procedurerne/foranstaltningerne som skal sikre et DNA frit miljø i forbindelse med håndtering af biopsier.
Konsekvens
Hvis der viser sig at være DNA-forurening i en blindprøve, evalueres procedurerne/foranstaltninger, som skal sikre et DNA-rent miljø. Forureningen dokumenteres i en afvigerapport, hvor der også beskrives en korrigerende handling. Dette vil typisk resultere i øget opmærksomhed på steril påklædning og/eller DNA dekontaminering af relevante utensilier (UV belysning). Desuden kan en dybdegående rengøring af rummet, mikroskop, mikromanipulator, PC og tastatur komme på tale.
