Annotering og udvælgelse af blastocyster/embryoner til transferering og vitrifikation vha. EmbryoViewer
Formål
At sikre en ensartet annotering og udvælgelse af embryoner/blastocyster til henholdsvis transferering og vitrificering.
Beskrivelse
Baggrund, anvendelse og gyldighed
Som udgangspunkt dyrkes alle embryoner i EmbryoScope og udvælgelsen af blastocyster/embryoner til transferering og vitrifikation baseres på de morfokinetiske annoteringer, der løbende er foretaget af embryonerne samt på Gardner Score af blastocyster
Ansvar
Biologen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonale ansvarlig for, at nye medarbejder informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personligt ansvarligt for at proceduren efterleves i praksis
Annoteringerne fra dag 0 til dag 2:
Følgende parametre skal annoteres for ALLE æg/embryoner til og med dag2:
• PN optståen
• PN fading (defineret som det tidspunkt, hvor netop ingen af PN’erne er synligt længere)
• Alle celledelinger
• Direkte delinger
• Fragmenteringsgraden
• Blastomerstørrelse (uens)
• Multinuklearitet:
Ud over den løbende annotering på Viewern, skal scoring angives på dyrkningsskemaet og opdateres i Formatex.
Følgende parametre kendetegner optimalt udviklingshastighed og morfologi
Optimalt udviklingsmønster (morfokinetik)
• PN opståen ca. 8-12 t efter insemination (der kan dog være ret stor variation)
• PN fading gerne omkring 21-25 t efter inseminering (kan medføre tidlig deling)
• Der skal optimalt gå ret præcis 3 t mellem PN fading og første celledeling
• Første celledeling (t2) gerne omkring 24-28 t efter inseminering (tidlig deling)
• Der skal gerne observeres 1 kerne i hver celle et stykke tid efter den første celledelingen
• Optimalt skal begge kerner fade ca. samtidigt for at resultere i en synkron deling til 4 celler
• Tiden, som embryonet er en 2-celle varer gerne ca. 8 til 12 timer. Dette gælder for alle celledelinger til og med morula, at tiden mellem celledelingerne skal være ca. 8 til 12 timer.
• Deling til 3 celle (t3) gerne 35-38 t efter insemination, men generelt så tæt op af deling til 4-celle som muligt for at sikre synkron deling. Den tid embryonet er en 3-celle skal dermed optimalt være så kort som overhovedet muligt
• Deling til 4-celle (t4) gerne omkring 36-39 t efter insemination
• Der skal optimalt kunne observeres 1 kerne i hver celle et stykke tid efter celledelingen
• T5 deling til 5-celle optimalt ca. omkring 48-53 t efter insemination og t5, t6, t7 og t8 skal generelt ske så tæt op af hinanden som muligt, hvilket er et udtryk for et embryon med synkront udvikling
• T8 (deling til 8-celle) omkring 60 timer, dog ±10t, alt efter hvordan delingstiming af de enkelte celler har været hidtil.
Generelt gælder det, at jo hurtigere embryonet er, jo bedre; dog indenfor de tidsvinduer, der er nødvendigt for at de kritiske biologiske processer kan tilvejebringes, som eksempel skal t2 ikke ske i det tidsinterval, hvor vi forventer at PN opstår og skal være synligt (ca. 8-21 t)
Scoring af befrugtning:
• 1 PN ved ICSI: Kunne der på intet tidspunkt ses 2PN, anvendes embryonet ikke
• 0 og 1 PN ved IVF: Embryoner, hvor der kun er set 1PN, men tydeligt 2 pollegemer kan anvendes, hvis delingsmønstret viser, at embryonet er ”kommet hurtigt fra start” og har et hurtigt men regelmæssigt delingsmønster, så må det formodes, at PN er fadet før vi har set på ægget.
Annotering og udvælgelse af blastocyster på dag 5/6
Der annoteres følgende parametre i EmbryoViewer, MEN KUN FOR DE EMBRYONER, DER ER BLEVET ELLER FORVENTES AT BLIVE TIL BRUGBARE BLASTOCYSTER
• antal celler (løbende annotering)
• direkte delinger, hvis de kan observeres
• morula
• graden af blastocyst udvikling
• scoring af ICM (Inner Cell Mas) og TE (trophectroderm), se nedenfor
På dag 5 ses på alle embryoner, og de embryoner, der ifølge Gardners blastocystscoring har udviklet sig til ”gode” eller ”topkvalitets” blastocyster er som udgangspunkt egnet til transferering.
• Der transfereres kun blastocyster uden C i scoringen.
• Man kan dog med B på dyrkningsskema indikere, at kvaliteten er lige netop dårligere end B, men at man vurderer, at blastocysten alligevel skal transfereres
• Blastocystscoren er mere afgørende end morfologiske parametre. Oplysning om fragmentering, direkte delinger, multinuklearitæt, ens/uens cellestørelse behøves derfor som udgangspunkt ikke inddrages i blastocystvurderingen. Det er dog tilladt at inddrage morfologiske oplysninger, hvis man synes, det giver mening.
• Oplysninger om blastocysternes delingsmønster kan inddrages til prioritering af blastocysterne ifølge ovenfor stående punkter under ”optimalt delingsmønster (morfokinetik)”.
• De annoterede morfologiske og kinetiske parametre skal bruges til senere retrospektive undersøgelse af sammenhæng mellem vores graviditetsrater for blastocyster og morfologiske parametre i det tidlige embryon. Ikke mindst derfor er det vigtigt, at vi annoterer de ønskede data konsistent og pålideligt.
Blastocysterne scores baseret på Gardner score Grad 1 –grad 6
Grad 1: Væskefyldt rum (blastocoel), som er mindre end det halve embryovolumen
Grad 2: Blastocoel, som er større end det halve embryonvolumen
Grad 3: En ”hel” blastocyst, hvor blastocoel udgør nu hele embryonet/blastocysten
Grad 4: Ekspanderet blastocyst (når zona er ca. ¾ del tynder end ved start), hvor blastocoel er større end embyonet og med en zona pellucida, der er ved at blive tyndere.
Grad 5: Blastocysten er begyndt at hatche
Grad 6: Blastocysten er fuld hatched
ICM (Inner Cell Mass)
A: Mange celler tæt ”pakket” sammen
B: Nogle celler; løst grupperet
C: Meget få celler løst bundet til hinanden
TE (Trophectoderm)
A: Mange celler, som danner en sammenhængende overflade af epithelceller
B: Få celler, der danner et løst epithelium
C: Meget få celler, der prøver at danne et sammenhængende epithelium
Top-/godkvalitets blastocystscore defineres således:
Top kvalitets blastocyster:
• 4AA, 4AB
• 5AA, 5AB
• 6AA, 6AB
God kvalitets blastocyster:
• 3AA, 3AB, 3BA, 3BB
• 4BA, 4BB
• 5BA, 5BB
• 6BA, 6BB
Den samlede vurdering af blastocystkvaliteten vil altid til en hvis grad være en subjektiv bedømmelse. Det er derfor rigtig vigtigt, at vi i laboratoriet jævnligt diskuterer embryoscoring med hinanden.
Vitrifikation:
Ved normal IVF/ICSI: Vitrificeres flere blastocyster prioriteres blastocysterne, således at nr.1 vurderes som den bedste blastocyst og ellers derned af.
Ved PGT: svarer Vx altid til det tilsvarende æg/blastocyst nr.x i sliden og på dyrkningsskemaet.
Ved normal FER behandling optøs blastocysterne i deres prioriteret rækkefølge, og er der blevet transfereret en frisk blastocyst, så er det den, der samlet set havde den bedste kvalitet (eller lige bedst med flere).
Ved undtagelsesvis transferering på dag2/3:
Antal celler på dag 2:
• 2-celler på dag 2 skal helst ikke transfereres. Man skal om morgenen på dag2 være opmærksom på, om der ses kerner i blastomererne eller ej, da det kan give oplysning om, om embryonet er på vej til at dele sig videre. Ser 2-cellen morfologisk fornuftigt ud, skal 2-cellen få en chance til kort før transfereringstidspunktet, i håb om at den deler sig. Hvis en sådan 2-celle har delt sig til en 3-celle før transfereringstidspunkt, kan denne 3-celle transfereres, da vi antager, at den anden celle deler sig lige om lidt (bedst er dog, at kernen i den ikke delte celle allerede er fadet).
• Alle andre 3-celler (som er 3-celler om morgenen og fortsat før transferering) transfereres IKKE.
• 4-celler er det optimale antal celler på dag2. Embryonet skal helst ikke have mere end 6 celler på dag2. Embryoner med flere celler kan transfereres hvis det samlede delingsmønster forklarer den hurtige deling og der ikke er bedre alternativ
• Generelt skal S faserne være så kort som muligt, dvs. så meget synkroni i delingerne som muligt
Antal celler på dag3;
• Antal celler, direkte delinger, fragmentering, multinuklearitæt, blastomerstørrelse annoteres til og med dag3
• 8-celler er optimalt på dag3
• Embryonet skal dog helst have mere end 5 celler.
• Embryoner med mindre end 5 celler transfereres som udgangspunkt IKKE. Transferering af 4celler kan dog undtagelse komme på tale, hvis et langsom men regelmæssig delingsmønster kan forklare dette antal celler, og der ikke er bedre bud blandt de embryoner der er i spil.
• Embryonet må godt have op til 10 celler. Flere celler og kompaktion til morula kan være et godt tegn, hvis det passer sammen med et hurtig men regelmæssigt delingsmønster. I så fald kan det godt transfereres.
• Generelt skal S faserne være så kort som muligt, dvs. så meget synkroni i delingerne som muligt
For både dag2 og dag3 scoring/transferering gælder følgende:
• Fragmentering: Embryoner med fragmenteringsgrad 3 skal kun transferers, som absolut undtagelse, og hvis det er, fordi dens morfokinetik er langt mere fornuftig end for de øvrige embryoner, der er i spil.
• Multinuklearitet: Embryoner skal som udgangspunkt IKKE transfereres. Er der ikke andet at transferere, kan det dog komme på tale, hvis morfokinetikken og fragmenteringsgraden er OK.
Dog tyder nogle studier på at 2-celle embryoner med binuclearitet (den form for multinuklearitet, hvor der er 2 ens store kerner i en celle og hvor kernestørrelserne svarer til den forventede kernestørrelse på cellens cellegeneration) i én eller begge blastomerer kan udvikle sig videre til biologisk kompetente embryoner. Dermed kan dag2/3 embryoner, hvor der IKKE ses multinuklearitæt udover på 2-celle stadie transferers, men har en law prioritet.
25% og meget uens, hvis størrelsesforskel er større end 50%). Repræsenterer cellerne forskellige cellegenerationer, så er en forskel i størrelsen naturligt.
• Direkte delinger: Direkte delinger er defineret som en celle, der deler sig til 3 eller flere celler inden for 5 timer. Embryoner/blastocyster, som udviser direkte delinger skal som udgangspunkt ikke transfereres. Der gælder dog generelt, at direkte delinger er værre jo tidligere de opstår. Den endelige vurdering om et embryon med forholdsvis sent direkte deling (eksempelvis efter 4-cellestadiet) undtagelsesvis kan transferers afhænger dog i sidste ende af den samlede morfologiske og kinetiske vurdering af det aktuelle embryon; også set i forholdt til de andre embryoner, der er i spil.
