Ignorer kommandoer på båndet
Gå til hovedindhold

Annotering og udvælgelse af blastocyster/embryoner til transferering og vitrifikation vha. EmbryoViewer

Formål

At sikre, at annotering og udvælgelse af embryoner/blastocyster dyrket i EmbryoScope sker i overensstemmelse med Fertilitetsenhedens, Aalborg Universitetshospital, politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.

 

Beskrivelse

Baggrund, anvendelse og gyldighed

Som udgangspunkt dyrkes alle embryoner i EmbryoScope og udvælgelsen af blastocyster/embryoner til transferering og vitrifikation baseres på de morfokinetiske annoteringer, der løbende er foretaget af embryonerne samt på Gardner Score af blastocyster

Ansvar

Biologen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonale ansvarlig for, at nye medarbejder informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personligt ansvarligt for at proceduren efterleves i praksis
 

Annoteringerne fra dag 0 til dag 2:

  • • Følgende parametre skal annoteres for ALLE æg/embryoner til og med dag2:

  • • PN optståen

  • • PN fading (defineret som det tidspunkt, hvor netop ingen af PN’erne er synligt længere)

  • • Alle celledelinger til og med dag2

  • • Direkte delinger til og med dag2

  • • Fragmenteringsgraden (så hvidt muligt i hvileperioderne mellem celledelingerne) til og med dag2

  • • Blastomerstørrelse (ens uens) til og med dag2

  • • Multinuklearitet:

  • • For 2 celler, skal der for hver af cellerne annoteres, om der er 0, 1 eller flere kerner

  • • For alle embryoner, der har mere end 2 celler annoteres kun synlige multinukleære blastomerer. Mononuklearitet og anuklearitet annoteres som udgangspunkt ikke aktivt.

 

Ud over den løbende annotering på Viewern, skal scoring angives på dyrkningsskemaet og opdateres i Formatex.

 

De traditionelle scoringer og deres tidspunkter fra dag0 til dag2/3 er følgende:

Ved 18-19t: PN

Ved 27t: tidlig deling

Ved 44t: Fragmenteringsgraden, antal blastomerer, blastomerstørrelse og kernestatus (angiv hvis multinuklearitæt)

Ved 68t: antal blastomerer og ved dag3 transferering også fragmenteringsgraden, blastomerstørrelse og kernestatus.

 

Annotering og udvælgelse af blastocyster på dag 5/6

Ved, som normalt planlagt dag5/6 transferering/vitrifikation annoteres følgende parametre i EmbryoViewer (MEN KUN FOR DE EMBRYONER, DER ER BLEVET ELLER FORVENTES AT BLIVE TIL BLASTOCYSTER)

Annotering fra dag0 til dag2 foretages, som beskreven ovenfor, derudover skal der annoteres:

  • • Antal celler på dag3 (ikke andre parametre).

  • • Derefter angives løbende med tiden

    • • antal celler (løbende annotering)

    • • morula

    • • graden af blastocyst stadie

    • • scoring af ICM (Inner Cell Mas) og TE (trophectroderm), se nedenfor

 

Ud over annoteringen i EmbryoViewer, skal scoringen angives på dyrkningsskemaet og opdateres i Formatex.

 

Blastocysterne scores baseret på Gardner score Grad 1 –grad 6

Grad 1: Væskefyldt rum (blastocoel), som er mindre end det halve embryovolumen

Grad 2: Blastocoel, som er større end det halve embryonvolumen

Grad 3: En ”hel” blastocyst, hvor blastocoel udgør nu hele embryonet/blastocysten

Grad 4: Ekspanderet blastocyst (når zona er ca. ¾ del tynder end ved start), hvor blastocoel er større end embyonet og med en zona pellucida, der er ved at blive tyndere.

Grad 5: Blastocysten er begyndt at hatche

Grad 6: Blastocysten er fuld hatched

 

ICM (Inner Cell Mass)

A: Mange celler tæt ”pakket” sammen

B: Nogle celler; løst grupperet

C: Meget få celler løst bundet til hinanden

 

TE (Trophectoderm)

A: Mange celler, som danner en sammenhængende overflade af epithelceller

B: Få celler, der danner et løst epithelium

C: Meget få celler, der prøver at danne et sammenhængende epithelium

 

Blastocystscoring foretages i overensstemmelse med nedenstående retningslinjer

  • • Som udgangspunkt transfereres eller vitrificeres kun blastocyster uden C i scoringen

  • • Alle blastocyster med en udviklingsgrad 3-6 gives en scoring, som kombinerer alle 3 parametre (udviklingsstatus, udviklingsgrad/kvalitet af ICM og TE), eksempelvis 4AB.

 

Man kan dog med B på dyrknings-/vitrifikationsskemaet indikere, at kvaliteten er lige netop dårligere end B, men at man vurderer, at blastocysten alligevel skal transfereres/vitrificeres

 

Top-/godkvalitets blastocystscore defineres således:

Top kvalitets blastocyster:

  • 4AA, 4AB

  • 5AA, 5AB

  • 6AA, 6AB

 

God kvalitets blastocyster:

  • 3AA, 3AB, 3BA, 3BB

  • 4BA, 4BB

  • 5BA, 5BB

  • 6BA, 6BB

 

  • • På dag 5 ses på alle embryoner og de embryoner, der ifølge ”Gardners” blastocyst scoring har udviklet sig til ”god-” eller ”topkvalitets” blastocyster er i princippet egnet til transferering eller vitrificering.

 

  • • Der ses og inddrages dog oplysninger om kvalitet fra de første dyrkningsdage således:

  • 1 PN ved ICSI: Kunne der på intet tidspunkt ses 2PN, anvendes embryonet ikke

  • 1 PN ved IVF: Embryoner, hvor der kun er set 1PN, men tydeligt 2 pollegemer, eller hvor der er set 2PN i mikroskop, Kan anvendes

 

For at få et samlet indtryk af embryonets/blastocystens kvalitet inddrages morfokinetikken, ifølge den længere ned beskrivelse af ”optimal morfokenetik” således:

  • • Oplysning om suboptimalt delingsmønster (direkte delinger, lange S-faser, asynkrone delinger, søster blastomerer med meget ulig store blastomerer mm.) og suboptimale morfologiske parametre (multinuklearitet, meget fragment) inddrages i blastocystranking. Mange embryoner vil på vej til dag 5/6 naturligt frasortere sig selv grundet dårlig/manglende kvalitet.

 

  • • Det gælder dog, at er ”man” blevet til en ”fornuftig” blastocyst, så er man i princippet egnet til transferering eller vitrifikation. Men direkte delinger og andet suboptimal delingsmønster noteres på vitrifikationsskema, og også suboptimal morfologiske parametre (multinuklearitet, meget fragment mm) inddrages i den samlede kvalitetsvurdering af blastocysterne.

 

  • • Fryseegnethed: Vi vitrificerer kun de blastocyster vi ”tror på”, og det er en faglig vurdering én hver af os træffer på baggrund af en grundig gennemgang af timelapse materialet og Gardner score.

 

  • • For normal IVF/ICSI: Vitrificeres flere blastocyster becifres blastocysterne, således at nr.1 vurderes som den bedste blastocyst og ellers derned af.

 

  • • Ved PGD: svarer Vx altid til det tilsvarende æg/blastocyst nr.x i sliden

 

  • • Ved normal FER behandling optøs blastocysterne i deres kvalitetsrækkefølge, og er der blevet transfereret en frisk blastocyst, så er det den, der samlet set havde den bedste kvalitet (eller lige bedst med flere).

 

  • • Ved PGD FER tøs og behandles med raske blastocyster

 

Den samlede vurdering af blastocystkvaliteten vil altid til en hvis grad være en subjektiv bedømmelse. Det er derfor rigtig vigtigt, at vi i laboratoriet jævnligt diskuterer embryoscoring med hinanden og altid hører en kollega, hvis vi er i tvivl, så vi minimerer graden af forskellighed i vores scoringer.

 

 

Generelle retningslinjer og definitioner for æg-/embryoudvikling fra dag 0 til og med dag3

Embryovurdering

 

Optimal Morfokinetik

  • • PN opståen ca. 8-12 t efter insemination (der kan dog være ret stor variation)

  • • PN fading gerne omkring 21-25 t efter inseminering (medfører tidlig deling)

  • • Der skal optimalt gå ret præcis 3 t mellem PN fading og første celledeling

  • • Første celledeling (t2) gerne omkring 24-28 t efter inseminering (tidlig deling)

  • • Der skal gerne observeres 1 kerne i hver celle et stykke tid efter celledelingen

  • • Optimalt skal begge kerner fade ca. samtidigt for at resultere i en synkron deling til 4 celler

  • • CC2 (tiden, som embryonet er en 2-celle) varer gerne ca. 11 til 12 timer

  • • S2 (den tid embryonet er en 3-celle) skal optimalt være så kort som overhovedet muligt

  • • Deling til 3 celle (t3) gerne 35-38 t efter insemination, men generelt så tæt op af deling til 4-celle som muligt for at sikre synkron deling.

  • • Deling til 4-celle (t4) gerne omkring 36-39 t efter insemination

  • • Der skal optimalt kunne observeres 1 kerne i hver celle et stykke tid efter celledelingen

  • • T5 deling til 5-celle optimalt ca. omkring 48-53 t efter insemination og t5, t6, t7 og t8 skal generelt ske så tæt op af hinanden som muligt, hvilket er et udtryk for et embryon med synkront udvikling

  • • T8 (deling til 8-celle) omkring 60 timer, dog ±10t, alt efter hvordan delingstiming af de enkelte celler har været hidtil.

 

Generelt gælder det, at jo hurtigere embryonet er, jo bedre; dog indenfor de tidsvinduer, der er nødvendigt for at de kritiske biologiske processer kan tilvejebringes, som eksempel

 

  • • T2 skal ikke ske i det tidsinterval, hvor vi forventer at PN opstår og skal være synligt lidt efter (ca. 8-21 t)

  • • T3 skal ikke ske tidligere end 5 t efter T2, ellers kategoriseres deling som direkte deling

 

Ved undtagelsesvis transferering på dag2/3 udvælges ved hjælp af ovenstående

  • • ”Generelle retningslinjer og definitioner for æg-/embryoudvikling fra dag0 til og med dag3”, samt nedenstående

  • • Nedenstående ”Retningslinjer for udvælgelse af embryoner til transferering ved dyrkning til dag2/3”.

 

Ved undtagelsesvis transferering på dag3 annoteres i EmbryoViewer ud over antal celler også, fragmenteringsgraden, blastomerstørrelse (ens/uens) og kernestatus.

 

Alle overskudsembryoner (i hvert fald dem, vi stadig ”kan tro på”) dyrkes videre til dag5/6, hvor beslutningen om vitrifikation tages.

 

Ud over annoteringen i EmbryoViewer, skal scoringen angives på dyrkningsskemaet og opdateres i Formatex.

 

Retningslinjer for udvælgelse af embryoner til transferering ved dyrkning til dag2/3:

  • • En fornuftig morfokinetik (jævnført ovenfor angivne beskrivelse) vejer tungere end moderat fragmentering og moderat uens blastomerstørrelse.

 

  • • Generelt skal S faserne være så kort som muligt, dvs. så meget synkroni i delingerne som muligt

 

  • • Celledelingerne skal helst føre til ens store søsterblastomerer.

 

  • • Embryoner med søsterblastomerer med en diameterforskel på ≥ 50% skal helst ikke transfereres. Beslutningen afhænger dog i sidste ende af den samlede morfologiske og morfokinetiske vurdering af det aktuelle embryon i forholdt til de andre embryoner, der er i spil.

 

  • • Ingen transferering/vitrificering af æg, hvor der utvivlsomt kun blev set 1PN

 

  • • Ses 0PN ved IVF-æg skal der ses nøje på kinetikken. Hvis der er tale om et hurtigt embryon, som deler sig i overensstemmelse med optimal kinetik, kan dette embryon være egnet til transferering, idet det kan være sandsynligt, at PN allerede er fadet før ægget er kommet i EmbryoScope. Ellers transferers/vitrificeres det ikke.

 

  • • Direkte celledelinger fra 1 til 3 celler skal IKKE transfereres/vitrificeres. Når t3 er ≤ 5 t efter t2 kategoriseres delingen som direkte deling.

  • • Direkte delinger på senere tidspunkter skal som udgangspunkt helst heller ikke transfereres/vitrificeres. Der gælder dog generelt, at direkte delinger er værre jo tidligere de opstår. Den endelige vurdering om et embryon med forholdsvis sent direkte deling (eksempelvis efter 4-cellestadiet) kan transferers afhænger dog i sidste ende af den samlede morfologiske og morfokinetiske vurdering af det aktuelle embryon i forholdt til de andre embryoner, der er i spil.

 

  • • Embryoner med fragmenteringsgrad 3 skal kun transferers, som absolut undtagelse og hvis det er fordi dens morfokinetik er langt mere fornuftig end morfokinetikken af de øvrige embryoner, der er i spil. Grad 3 embryoner vitrificeres ikke.

 

  • • Multinukleære embryoner skal som udgangspunkt IKKE transfereres. Er der ikke andet at transferere, kan det dog komme på tale, hvis morfokinetikken og fragmenteringsgraden er OK. Multinukleare embryoner skal som udgangspunkt ikke vitrificeres.

 

  • • Nogle nyere studier tyder på at 2-celle embryoner med binuclearitet (den form for multinuklearitet, hvor der er 2 ens store kerner i en celle og hvor kernestørrelserne svarer til den forventede kernestørrelse på cellens cellegeneration) i én eller begge blastomerer kan udvikle sig til kompetente 4-celle embryoner (og senere hen blastocyster) med én kompetent kerne per blastomer. Udvikler en binuclear 2-celle sig morfokinetik fornuftigt gennem de efterfølgende celledelinger, kan dette embryon transfereres, hvis der ikke er bedre alternativ. Ved sådant et embryon, skal vi være ekstra opmærksomme på kernestatus efter 2-cellen har delt sig videre, idet det er et dårligt tegn, hvis der også ses multinuklearitet på senere cellestadier.

 

  • • 2-celler på dag 2 skal helst ikke transfereres. Man skal om morgenen på dag2 være opmærksomme på, om man ser kerner i blastomererne eller ej, da det kan give oplysning om, om embryonet er på vej til at dele sig videre. Ser 2-cellen morfologisk fornuftigt ud og morfokinektikken er OK, skal 2-cellen få en chance til kort før transfereringstidspunktet, i håb om at den deler sig. Hvis en sådan 2-celle har delt sig til en 3-celle før transfereringstidspunkt, kan denne 3-celle transfereres, da vi antager, at den anden celle deler sig lige om lidt (bedst er dog, at kernen i den ikke delte celle allerede er fadet).

 

  • • Alle andre 3-celler (som er 3-celler om morgenen og fortsat før transferering) transfereres IKKE.

 

  • • Der skal helst ikke være mere end 6-celler om morgenen på dag 2; dog afhænger beslutningen om et embryon med ”lige lovlig” mange celler kan transferers, om morfokinetikken er OK i forhold til de embryoner, der ellers er i spil

 

  • • Alle potentielle vitrificerings egnede embryoner dyrkes videre til dag5/6

 

 

Ved dag3 dyrkning gælder alle ovenfor nævnte punkter for dag2 dyrkning med følgende tilføjelser:

  • • Embryonet skal helst have mere end 6 celler.

 

  • • Embryoner med mindre end 6 celler transfereres som udgangspunkt IKKE. Undtagelse kan dog komme på tale, hvis en langsom men regelmæssig morfokinetik kan forklare dette antal celler og der ikke er bedre bud blandt de embryoner der er i spil.

 

  • • Embryonet må godt have op til 10 celler og kompaktion kan være et godt tegn, hvis det passer sammen med en hurtig med regelmæssig morfokinetik. I så fald kan det godt transfereres.

 

  • • Alle potentielle vitrificerings egnede embryoner dyrkes videre til dag5/6

 

Referencer

I laboratoriet findes en mappe med en udførlig brugermanual: ”EmbryoViewer™ User manual”