Annotering og udvælgelse af blastocyster/embryoner dyrket i standardinkuator (oftest Miri’en) til transferering og vitrifikation
Formål
At sikre, at annotering og udvælgelse af embryoner/blastocyster dyrket i standard inkubator/bordinkubator er i overensstemmelse med Fertilitetsenhedens, Aalborg Universitetshospital, politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.
Beskrivelse
Ansvar
Biologen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonale ansvarlig for, at nye medarbejder informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personligt ansvarligt for at proceduren efterleves i praksis
Baggrund, anvendelse og gyldighed
Som udgangspunkt dyrkes alle embryoner i Embryo Scope.
Undtagelsesvis dyrkning af embryoner/blastocyster i standardinkubator/bordinkubator (oftest pga. pladsmangel i EmbryoScope) sker i Petriskåle (diameter max. 6cm) i 25µl dyrkningsdråber overlejret med olie, som optimalt skal være gjort klar dagen før (min. 3 timer før).
Fremgangsmåde
Ved nedenfor angivne tidspunkter tages skålen med embryonerne/blastocysterne ud af inkubatoren og der undersøges under mikroskopet (400 eller 200 x forstørelse) for PN, EC, scoring af dag2 embryon og scoring af dag3 og scoring på dag5/6
De traditionelle scoringer og deres tidspunkter fra dag0 til dag2/3 er følgende:
Ved 18-19t (om morgenen på dag1): PN
Ved 27t (om eftermiddagen på dag1): ”early cleavage” (EC)
Ved 44t (dag2 om morgenen): Fragmenteringsgraden, antal blastomerer, blastomerstørrelse og kernestatus (angiv hvis multinuklearitæt)
Ved 68t (dag3 om morgenen): antal blastomerer (og kun ved dag3 transferering også fragmenteringsgraden, blastomerstørrelse og kernestatus)
Blastocysterne scores baseret på Gardner score
Grad 1 –grad 6
Grad 1:
Væskefyldt rum (blastocoel), som er mindre end det halve embryovolumen
Grad 2:
Blastocoel, som er større end det halve embryonvolumen
Grad 3:
En ”hel” blastocyst, hvor blastocoel udgør nu hele embryonet/blastocysten
Grad 4:
Ekspanderet blastocyst (når zona er ca. ¾ del tynder end ved start), hvor blastocoel er større end embyonet og med en zona pellucida, der er ved at blive tyndere.
Grad 5:
Blastocysten er begyndt at hatche
Grad 6:
Blastocysten er fuld hatched
ICM (Inner Cell Mass)
A: Mange celler tæt ”pakket” sammen
B: Nogle celler; løst grupperet
C: Meget få celler løst bundet til hinanden
TE (Trophectoderm)
A: Mange celler, som danner en sammenhængende overflade af epithelceller
B: Få celler, der danner et løst epithelium
C: Meget få celler, der prøver at danne et sammenhængende epithelium
Vi forholder os til blastocystscoring i overensstemmelse med nedenstående retningslinjer
Som udgangspunkt transfereres eller vitrificeres kun blastocyster uden C i scoringen
Alle blastocyster med en udviklingsgrad 3-6 gives en scoring, som kombinerer alle 3 parametre (udviklingsstatus, udviklingsgrad/kvalitet af ICM og TE), eksempelvis 4AB.
Man kan dog med B på dyrknings-/vitrifikationsskemaet indikere, at kvaliteten er lige netop dårligere end B, men at man vurderer, at blastocysten alligevel skal transfereres/vitrificeres
Top-/godkvalitets defineres blastocystscore således:
Top kvalitets blastocyster:
4AA, 4AB
5AA, 5AB
6AA, 6AB
God kvalitets blastocyster:
3AA, 3AB, 3BA, 3BB
4BA, 4BB
5BA, 5BB
6BA, 6BB
På dag 5 (om morgenen) ses på alle embryoner og de embryoner, der ifølge Gardners blastocyst scoring har udviklet sig til ”god-” eller ”topkvalitets” blastocyster er i princippet egnet til transferering eller vitrificering.
Der ses og inddrages dog oplysninger om kvalitet fra de første dyrkningsdage således:
Dag1:
• 1 PN ved ICSI: Kunne der på intet tidspunkt ses 2PN, anvendes embryonet ikke
• 1 PN ved IVF: Embryoner, hvor der kun er set 1PN, men tydeligt 2 pollegemer, kan anvendes
Dag2:
• Helst 4 blastomerer (ved ca 44 timer), men 2, 3 og 5, 6 celler ses også og kan være OK
• Helst éns størrelse af blastomerer fra samme cellegeneration (annoteres som uens, hvis forskellen på cellernes diameter er mere end 25% og meget uens hvis størrelsesforskel er større end 50%)
• Fragment (mere end 20% fragmentering kompromitterer embryokvaliteten i nogen grad)
• Multinuklearitet: (multinuklearitet er en kompromitterende faktor for embryokvaliteten)
Dag3:
Annoteringen angives på dyrkningsskemaet og i Formatex
Fryseegnethed/FER behandling
• Fryseegnethed: Vi vitrificerer kun de blastocyster vi ”tror på”, og det er en faglig vurdering én hver af os træffer på baggrund af en grundig gennemgang af scoringens parametre og hvordan blastocysten står frem under mikroskopet.
• For normal IVF/ICSI: Vitrificeres flere blastocyster becifres blastocysterne, således at nr.1 vurderes som den bedste blastocyst og ellers derned af.
• Ved PGD: svarer Vx altid til det tilsvarende æg/blastocyst nr.x i sliden og på dyrkningsskemaet
• Ved normal FER behandling optøs blastocysterne i deres kvalitetsrækkefølge, og er der blevet transfereret en frisk blastocyst, så er det den, der samlet set havde den bedste kvalitet (eller lige bedst med flere).
• Ved PGD FER tøs og behandles med raske blastocyster
• Den samlede vurdering af blastocystkvaliteten vil altid til en hvis grad være en subjektiv bedømmelse. Det er derfor rigtig vigtigt, at vi i laboratoriet jævnligt diskuterer embryoscoring med hinanden og altid hører en kollega, hvis vi er i tvivl, så vi minimerer graden af forskellighed i vores scoringer.
Retningslinjer for udvælgelse af embryoner til transferering ved dyrkning til dag2/3:
Ved undtagelsesvis transferering på dag2/3 udvælges ved hjælp af ”Generelle retningslinjer og definitioner for æg-/embryoudvikling fra dag0 til og med dag3”, samt nedenstående:
• En fornuftig morfokinetik (jævnført ovenfor angivne beskrivelse) vejer tungere end moderat fragmentering og moderat uens blastomerstørrelse.
• Celledelingerne skal helst føre til ens store søsterblastomerer.
• Embryoner med søsterblastomerer med en diameterforskel på ≥ 50% skal helst ikke transfereres. Beslutningen afhænger dog i sidste ende af den samlede morfologiske og morfokinetiske vurdering af det aktuelle embryon i forholdt til de andre embryoner, der er i spil.
• Ingen transferering/vitrificering af æg, hvor der utvivlsomt kun blev set 1PN
• Ses 0PN ved IVF-æg skal det vurderes, om der er tale om et hurtigt embryon, som deler sig i overensstemmelse med god, dog lidt hurtigt, udviklingsmønster. I så fald kan dette embryon være egnet til transferering, idet det kan være sandsynligt, at PN allerede er fadet. Ellers transferers/vitrificeres det ikke.
• Embryoner med fragmenteringsgrad 3 skal kun transferers, som absolut undtagelse og kun, hvis det er bedste bud blandt de aktuelle embryoner.. Grad 3 embryoner vitrificeres ikke.
• Multinukleære embryoner skal som udgangspunkt IKKE transfereres. Er der ikke andet at transferere, kan det dog komme på tale, hvis udviklingsmønstret og fragmenteringsgraden er OK. Multinukleare embryoner skal som udgangspunkt ikke vitrificeres.
• Nogle nyere studier tyder på at 2-celle embryoner med binuclearitet (den form for multinuklearitet, hvor der er 2 ens store kerner i en celle og hvor kernestørrelserne svarer til den forventede kernestørrelse på cellens cellegeneration) i én eller begge blastomerer kan udvikle sig til kompetente 4-celle embryoner (og senere hen blastocyster) med én kompetent kerne per blastomer. Udvikler en binuclear 2-celle sig fornuftigt gennem de efterfølgende celledelinger, kan dette embryon transfereres, hvis der ikke er bedre alternativ. Ved sådant et embryon, skal vi være ekstra opmærksomme på kernestatus efter 2-cellen har delt sig videre, idet det er et dårligt tegn, hvis der også ses multinuklearitet på senere cellestadier.
• 2-celler på dag 2 skal helst ikke transfereres. Man skal om morgenen på dag2 være opmærksomme på, om man ser kerner i blastomererne eller ej, da det kan give oplysning om, om embryonet er på vej til at dele sig videre. Ser 2-cellen morfologisk fornuftigt ud, skal 2-cellen få en chance til kort før transfereringstidspunktet, i håb om at den deler sig. Hvis en sådan 2-celle har delt sig til en 3-celle før transfereringstidspunkt, kan denne 3-celle transfereres, da vi antager, at den anden celle deler sig lige om lidt (bedst er dog, at kernen i den ikke delte celle allerede er fadet).
• Alle andre 3-celler (som er 3-celler om morgenen og fortsat før transferering) transfereres IKKE.
• Alle potentielle vitrificerings egnede embryoner dyrkes videre til dag5/6
Ved dag3 dyrkning gælder alle ovenfor nævnte punkter for dag2 med følgende tilføjelser:
• Embryonet skal helst have mere end 6 celler.
• Embryoner med mindre end 6 celler transfereres som udgangspunkt IKKE. Undtagelse kan dog komme på tale, hvis en langsom men regelmæssig udvikling kan forklare dette antal celler, og der ikke er bedre bud blandt de embryoner der er i spil.
• Embryonet må godt have op til 10 celler og kompaktion kan være et godt tegn, hvis det passer sammen med en hurtig med regelmæssigudvikling hidtil.. I så fald kan det godt transfereres.
• Alle potentielle vitrificerings egnede embryoner dyrkes videre til dag5/6
