Vitrifikation af blastocyster med Irvine medie

Formål

At sikre ensartet vitrifikation med Irvine medie af blastocyster på dag 5/6 efter aspiration i overensstemmelse med Fertilitetsenheden Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.

Beskrivelse

Ansvar

Laboratorielederen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonalet ansvarlig for, at nye medarbejdere informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personlig ansvarlig for, at proceduren efterleves i praksis.

Apparatur, utensilier og reagenser

Apparatur

Utensilier

Reagenser

ESCO flowbænk

Stereomikroskop (Nikon SMZ1500)

Minutur

250 µm pipette

100 µl pipettespids + pipette

Petriskål 6 cm

Pincet

Flamingokasse med stålindsats til flydende nitrogen

Cryotech strå

Visotube

Irvine vitrification freeze kit:

ES (Equilibration solution)

VS (Vitrification Solution)

CSCM dyrkningsmedie

Blastocysterne scores og det vurderes om der er blastocyster til vitrifikation. (Kollapsede blastocyster kan også fryses).

Klargøring af bakker

1. Klargjort vitrifikationsskål mærkes med patient label og blastocyster, der skal vitrificeres overføres hertil.
2. En 6 cm petriskål pr. strå mærkes med patient ID.
3. Placering til hver strå i fryser udvælges og registreres således:
1. 3.1. Ved hjælp af oversigtsskema (Excel ark: Mortek Rack A – D)[1] findes en ledig placering i Mortek LN₂-fryseren.
2. 3.2. I excel arket markeres pladsen med et ’X’ for at indikere, at pladsen er optaget.
3. 3.3. For at minimere risiko for fejl, må der kun være en farve for hver patient i hver boks.
4. 3.4. Placering og farvekode noteres på dyrkningsskema.
5. 3.5. I Formatex registreres hvilke blastocyster der vitrificeres. Blastocystens placering i fryser, farvekode og prioritet registreres også (ved PGT- patienter er prioritetsnummer det samme som blastocyst nummer i formatex).

Strå og visotube mærkes med id

4. Strået mærkes med frysefast label påført patientens CPR-nr., cyklus ID og prioritetsnummer (f.eks. V1).

5. Farvet visotube mærkes med patientens navn, CPR-nr., dato for vitrifikation, hulnummer og prioritetsnummer.

Håndtering af flydende kvælstof og strå

6. Flamingokassen med stålindsatsen fyldes med flydende kvælstof og placeres på et rullebord, så det kan flyttes hen til flowbænken.

7. Visotubes og stråets yderrør placeres i karret med flydende kvælstof.
8. Sørg for, at der er kvælstof i tuben under hele processen.

Fremgangsmåde

9. Der arbejdes i kold bænk.

10. Medie tages ud af køleskabet mindst 30 min. før brug. Mediet skal have opnået stuetemperatur (22-27°C) inden brug.
11. Mediet blandes grundigt. Der afpipetteres 60 µl af ES og VS i cryotubes pr. blastocyst der skal vitrificeres. På pakken noteres dato for åbning, samt hvor mange der er brugt.
12. 50 µl ES afpipetteres øverst i den klargjorte 6 cm petriskål.
13. Blastocysten afsættes med 250 µm denuderingspipette i ES med så lidt dyrkningsmedie som muligt og minuturet startes.
14. Lige inden de 10 min. er gået, afpipetteres 50 µl VS i petriskålen nedenfor ES dråben (se tegning).
15. En ny 250 µm denuderingspipette tages i brug for at undgå olie i resten af proceduren.
16. Blastocysten flyttes til VS dråben efter 10 min. med så lidt ES i pipetten som muligt.
17. Skyl pipetten og flyt derefter blastocysten til et nyt sted i dråben.
18. Efter 50 sek. i VS loades blastocysten på strået på følgende måde:
1. 18.1. Sug blastocysten op i spidsen af pipetten.
2. 18.2. Blastocysten afsættes på strået, som holdes vandret. Den sorte spids vender væk fra en

selv.

1. 18.3. VS suges af, så blastocysten ligger i så lidt medie som muligt. Drej evt. strået til lodret stil-

ling for nemmere at suge medie fra.

19. Strået overføres med det samme til karret med flydende kvælstof og strået bevæges frem og tilbage med kraftige bevægelser for, at blastocysten nedkøles hurtigt.
20. Strået og yderrøret samles og puttes i visotuben under flydende kvælstof ved hjælp af en pincet. De skal først samles, når der ikke længere dannes bobler i det flydende kvælstof.

$H:\My Pictures\Irvine fryse tø medier\09102020 vitrifikation af blastocyster.png$

Risikovurdering

• Ækvælibrering i ES tager typisk mellem 6 – 10 min. Når blastocysten er kollapset og re-ekspanderet igen er den klar til at blive overført til VS.
• Re-ekspanderer blastocysten ikke, overføres den til VS efter 10 min. i ES.
• Blastocysten skal være loadet på strået og nedsænket i flydende kvælstof indenfor 80 sek.
• Eksponering i VS dråbe, loading og nedsænkning i flydende kvælstof må samlet ikke overskride 110 sek.
• Er blastocysten hatched kan det være en fordel, at der efterlades lidt mere VS end normalt, da det kan afhjælpe warming proceduren ift. at blastocysten slipper strået.

[1] Excel ark kan findes enten via Teams eller følgende placering: Region Nordjylland\IVF_Faelles (drev) - Dokumenter\General\Laboratorium\Fryseskema.

// <![CDATA[ _spBodyOnLoadFunctionNames.push("setupPageDescriptionCallout"); // ]]>