Vitrifikation af oocytter med Irvine medie

Formål

At sikre ensartet vitrifikation af oocytter efter aspiration og denudering i overensstemmelse med Fertilitetsenheden Aalborg Universitetshospitals politik, mål og kravgrundlag i øvrigt.

Beskrivelse

Baggrund, anvendelse og gyldighed

Nedfrysning af oocytter kan i særlige tilfælde være en mulighed. Oocytterne skal denuderes inden de vitrificeres (se forskriften ”ICSI”). Det er vigtigt, at alle cumuluscellerne fjernes. Kun MII oocytter vitrificeres. Der efterstræbes, at oocytterne nedfryses inden for 1-2 timer efter aspiration (ca. 38 timer efter hCG).

Ansvar

Laboratorielederen har det overordnede ansvar for proceduren. I den daglige drift er laboratoriepersonalet ansvarlig for, at nye medarbejdere informeres og undervises i proceduren. Medarbejderen er herefter personlig ansvarlig for, at proceduren efterleves i praksis.

Apparatur, utensilier og reagenser

Apparatur

Utensilier

Reagenser

ESCO Flowbænk

Stereomikroskop (Nikon SMZ1500)

Minutur

250 µm pipette

100 µl pipettespids + pipette

Petriskål 6 cm

Pincet

Flamingokasse med stålindsats til flydende nitrogen

Cryotech strå

Visotube

Irvine vitrification freeze kit:

ES (Equilibration solution)

VS (Vitrification Solution)

MHM medie

CSCM dyrkningsmedie

Klargøring af bakker

1. En 6 cm petriskål pr. strå mærkes med patient ID.
2. Placering til strå udvælges og registreres således:
1. 2.1. Ved hjælp af oversigtsskema (Excel ark: Mortek Rack A – D)[1] findes en ledig placering i Mortek LN₂-fryseren.
2. 2.2. I excel arket markeres pladsen med et ’X’ for at indikere, at pladsen er optaget.
3. 2.3. For at minimere risiko for fejl, må der kun være en farve for hver patient i hver boks.
4. 2.4. Placering og farvekode noteres på dyrkningsskemaskemaet for oocytter.
5. 2.5. I Formatex registreres, at oocytterne er denuderet og vitrificeret, samt deres placering i fryser, farvekode og priotet (tilfældig prioritet).

Strå og visotube mærkes med id:

3. Strået mærkes med frysefast label påført patientens CPR-nr., cyklus ID og evt. med nummer O1,O2…

4. Farvet visotube mærkes med patientens navn, CPR-nr., dato for vitrifikation, hul nummer og prioritetsnummer.
5. Der må gerne placeres flere strå i samme visotube.

Håndtering af flydende kvælstof og strå

6. Flamingokassen med stålindsatsen fyldes med flydende kvælstof og placeres på et rullebord, så det kan flyttes hen til flowbænken.

7. Visotubes og stråets yderrør placeres i karret med flydende kvælstof.
8. Sørg for, at der er kvælstof i tuben under hele processen.

Fremgangsmåde

9. Der arbejdes i kold bænk.

10. Medie tages ud af køleskabet mindst 30 min. før brug.
11. Alle medier skal have opnået stuetemperatur (22-27°C) inden brug.
12. Mediet blandes grundigt. Der afpippeteres 70 µl af ES og VS i cryotubes pr. strå. På pakken noteres dato for åbning, samt hvor mange der er brugt.
13. Afpipetter 20 µl MHM medie (se tegning).
14. 2 ocytter afsættes med 250 µm denuderingspipette i MHM medie, hvor de ligger uforstyrret i 1 min.
15. Afpipetter tre 20 µl ES dråber i petriskålen (se tegning – afsæt dråberne tæt, men uden at de rører hinanden).
16. Efter 1 min. laves der bro til ES1 med pipettespidsen.
17. Efter 2 min. laves der bro til ES2 med pipettespidsen.
18. Overfør oocytterne efter 2 min. til ES3 med så lidt medie som muligt og lad dem ligge uforstyrret i 10 min..
19. Lige inden de 10 min. er gået, afpipetteres 50 µl VS under ES3 dråben (se tegning).
20. En ny 250 µm denuderingspipette tages i brug for at undgå olie i resten af proceduren.
21. Overfør oocytterne efter 10 minutter til VS med så lidt medie som muligt.
22. Skyl pipetten og flyt derefter ooccytterne til et nyt sted i dråben.
23. Efter 60 sek. i VS loades oocytterne på strået på følgende måde:
1. 23.1. Sug oocytterne op i spidsen af pipetten.
2. 23.2. Oocytterne afsættes på strået, som holdes vandret. Den sorte spids vender væk fra en

selv.

1. 23.3. VS suges af, så oocytterne ligger i så lidt medie som muligt. Drej evt. strået til lodret stilling

for nemmere at suge medie fra.

24. Strået overføres med det samme til karret med flydende nitrogen og strået bevæges frem og tilbage med kraftige bevægelser for, at oocytten nedkøles hurtigt.
25. Strået og yderrøret samles og puttes i visotuben under flydende nitrogen ved hjælp af pincet. De skal først samles, når der ikke længere dannes bobler i det flydende kvælstof.

Loading skal ske indenfor 50 sek. Samlet skal proceduren i VS skal ske indenfor max 110 sek.

$H:\My Pictures\Irvine fryse tø medier\09102020 vitrifikation af oocytter.png$

Risikovurdering

• I dråben med ES3 ækvælibreres oocytterne uforstyrret mellem 6 – 10 min. Når oocytten er kollapset og re-ekspanderet til mindst 80% af den oprindelige volumen er den den klar til at blive overført til VS.
• Re-ekspanderer oocytten ikke, overføres den til VS efter 10 min. i ES3 dråben.
• Oocytten skal være loadet på strået og nedsænket i flydende kvælstof indenfor 80 sek.
• Eksponering i VS dråbe, loading og nedsænkning i flydende kvælstof må samlet ikke overskride 110 sek.

[1] Excel ark kan findes enten via Teams eller følgende placering: Region Nordjylland\IVF_Faelles (drev) - Dokumenter\General\Laboratorium\Fryseskema.

// <![CDATA[ _spBodyOnLoadFunctionNames.push("setupPageDescriptionCallout"); // ]]>